背景介绍：组织工程技术的最新进展使研究人员能够开发厚层组织结构，然后将其移植应用到再生治疗中去。然而目前临床应用上，至关重要的是所植入的工程化组织在使用前是安全和功能化的。但是目前对厚层组织构建的实时质量评价的研究是有限的。本论文研究人员开发了一个关于工程组织活性进行定量化的系统，用于实时评估组织的相关性能。研究人员在对工程组织活性的评估是通过测量沿垂直轴方向的氧浓度以及应用光学相干断层扫描（OCT）获得工程组织的横断面图像来判断工程组织的厚度，并应用氧微电极技术获得的培养的组织细胞的氧浓度，获取关于与工程组织性能相关的三个重要的参数，并得出了一种关于生物工程组织的活性可以通过测量组织内部的氧梯度来实时监测的方法。


Unisense微电极系统的应用


使用尖端直径为10微米的克拉克型氧微电极结合三维操作器测试了培养皿中层状细胞目标区域中的氧浓度，氧微电极是先直接插入培养皿表面的层状细胞层中直至微电极尖端恰好接触到培养皿底部后，然后使用自动三维操作器控制微电极向上移动10um并等待10分钟，然后沿垂直轴方向测试培养皿中的溶解氧分布，其中微电极的每次测试间隔距离为为40毫米，直到微电极尖端从培养皿表面的培养基中露出来为止。


实验结果


本论文研究开发了一个关于工程组织活性进行定量化的系统，从中实时评估工程组织的性能。工程组织活性的评估过程通过测量沿垂直轴方向的氧浓度以及应用光学相干断层扫描（OCT）获得工程组织的横断面图像来判断工程组织的厚度。得到了工程组织上方的氧浓度，培养基质中和工程组织上方区域的垂直轴上形成的氧梯度、组织内部实时形成的氧梯度。其中组织内部实时形成的氧梯度这个参数用于评价培养过程中工程组织的性能。这说明生物工程组织的活性可以通过测量组织内部的氧梯度来实时监测。所提出的测量策略可应用于开发更有效的组织培养方法，并支持了厚工程组织的培养提供了实时确认定量的依据。

图1、研究流程示意图。图(A)表示的是单个测试实验的时间安排表。图(B)表示的是应用氧微电极测试培养的层状细胞氧浓度剖面的测试方法。(C)测试一定厚度的含层状细胞的氧剖面浓度确定的定三种参数:POC(样品中细胞周围的氧浓度)、gradOxmedium(样品中培养基中的氧梯度)gradOxytissuess(样品中细胞组织的氧梯度)。图(D)表示的是光学相干断层扫描（OCT）系统获得的横断层面截流动影像图。

图2、在正常培养皿中培养的细胞组织样本在一次实验中获得的一个示例实验数据集。并给出了在第0天(图A所示)，第1天(图B所示)和第5天(图C所示)培养周期的三层的成肌细胞样本测试数据。左边的图表示的是氧的剖面浓度分布。其中图中显示的氧气浓度值的是与培养基与空气界面处的氧浓度（Csat）的比值。一条垂直线表示的是层状细胞和培养基之间的边界。样品组织的平均厚度就是显示在这条线附近区域。圆括号中的数值表示层状细胞内的氧浓度与培养基与空气界面处的氧浓度（Csat）的比值。右边的图显示的是重组的组织样本中心区域的3d图像的侧面和顶部视图，应用的是OCT系统获得的横断层面影像图。其中不同的空隙率值采用了不同的颜色表现出来。

图3、在0-5天的培养过程中测量的细胞组织样品厚度、细胞培养时间、细胞周围氧浓度（POCs）之间的相关性实验。其中图(A)在正常培养皿上进行细胞培养；图(B)在细胞培养池进行培养。其中图中的第0天、第1天和第5天获得的数据分别采用三角形、正方形及×形表示以便区分。

图4、在单个实验中使用细胞池培养的样本获得的数据。本论文中的实验数据案例是在(A)第0天、(B)第1天和(C)第5天的三层成肌细胞样本中获得的数据。其中左边左边的图表示的是氧的剖面浓度分布，右边的图表示的是采用了OCT系统获得的横断层面影像图。其中不同的空隙率值采用了不同的颜色表现出来。圆括号中的数值表示层状细胞内的氧浓度与培养基与空气界面处的氧浓度（Csat）的比值。

图5、提出用葡萄糖消耗率来评价层状细胞的活力指数。其中图(A-C)表示的是培养单、双、三层的细胞组织所需的葡萄糖消耗速率。其中的细胞组织的培养是正常的培养皿(●)或细胞池(□)上培养。图中的所获得的实验点是根据测量所用的时间间隔绘制的。图(D-F)表示的△GCR指数定义为DGCRDay 4-5-GCR Day 0-1]/GCR Day0-1，其中的获取的数据是分别从单层、双层和三层细胞组织中获得的，横坐标表的是在正常的培养皿中和在细胞池中进行培养的方法。


结论与展望


为了恢复受损组织和器官的功能，研究人员首次提出关于将功能细胞移植到受损组织中的技术方案。移植细胞被认为可以分泌细胞因子和趋化因子，从而诱导血管生成抗纤维化，抗凋亡，并将干细胞植入受损组织。随着研究人员对厚组织的临床应用研究的不断深入，厚组织的临床应用也越来越多重要，但是移植的厚结构组织在使用前需要了解其是否安全有效，目前对于这一类的研究报道较少。本论文研究人员开发一种实时测量氧浓度的系统方法，研究人员在评价组织的性能时采用了unisense公司生产的克拉克型氧气微电极，该微电极可以实现对于组织细胞培养环境中关于细胞组织上方的氧浓度、培养基质中和工程细胞组织上方区域的垂直轴上形成的氧梯度以及细胞组织内部实时形成的氧梯度测试。获取的这三个重要的氧浓度参数对于判断工程细胞组织的活性及组织的功能化的非常重要，这也意味着生物工程组织的活性是可以通过测量组织内部的氧梯度来实时监测完成的。这种测量策略的提出为今后的在厚工程组织的培养提供了实时确认定量的方法。这也另一个侧面说明了丹麦Unisense公司开发的克拉克型氧微电极在移植细胞培养工程学领域方面存在非常好的应用前景。