微电极具有几何尺寸小、传质速率快、i R降低、响应快速等优点，已被广泛应用于生命科学、环境检测、临床诊断等多个领域。离子选择性电极作为一种经典的电化学传感器，已经发展成为离子分析和电位传感的理想工具。离子选择性微电极可以为单细胞及沉积物孔隙水等微环境中各种离子的分析提供一种有效的检测手段。自然水体中存在的单细胞生物是环境刺激所引起的生态效应最为直接的生物机体，可作为研究环境刺激所引发的毒理效应的理想模型。细胞内外离子浓度的变化是细胞受到环境刺激产生的毒理效应的前期阶段。与已有的用于单细胞离子检测的膜片钳及荧光指示剂技术相比，电位型微电极传感器具有成本低、操作简单、响应快速、线性范围宽、高的时间和空间分辨率等优点。开发电位型微电极用以监测单细胞膜表面离子浓度变化，对于研究环境刺激下细胞应激变化具有重要的科学价值和应用前景。沉积物孔隙水微环境中的重金属离子与其生物可利用性以及生物地球化学过程等环境行为密切相关。因此，实现沉积物孔隙水中重金属离子的准确、快速、灵敏检测具有重要意义。


目前，沉积物孔隙水中重金属离子的检测一般采用现场提取与后续实验室化学分析和仪器检测相结合的方式。近年来，薄膜扩散平衡(DET)和薄膜扩散梯度(DGT)等技术被用于测定沉积物孔隙水中的重金属离子。然而，这些技术操作复杂且耗时长。发展新型电位型微电极，可为孔隙水中重金属的现场、快速、原位检测提供一种新的途径。与传统内充液式离子选择性电极相比，全固态离子选择性电极具有易于小型化、灵敏度高、操作简单等优点。然而，高灵敏全固态电位型微电极的构建及其在单细胞毒理分析及孔隙水检测中的应用鲜有关注。本论文制备了检出限低、抗干扰能力强且电位响应稳定的高灵敏全固态离子选择性微电极，并探索了其在单细胞分析及沉积物孔隙水检测中的应用。


本文实现了单细胞生物-草履虫细胞膜表面钙离子浓度变化的检测以及沉积物孔隙水中铜、铅等离子的检测。本文发展的电位型微电极为单细胞毒理分析和沉积物重金属的现场、原位检测提供了技术支撑。


研究工作概括如下:


1.钙离子选择性微电极的制备及表征钙离子不仅是细胞内常量元素，也是细胞内重要的第二信使，其含量变化对于细胞生理活动至关重要。与光学检测方法相比，钙离子选择性微电极具有线性范围宽、抗干扰能力强等优点，是检测单细胞钙离子浓度变化的理想工具。已有的电位型微电极多为内充液式微电极，而全固态钙离子选择性微电极尚未见报道。本研究采用火焰熔融法，制备了碳纤维微电极(直径为1-2μm)；采用电沉积法，制备了导电聚合物3，4-乙烯二氧噻吩-聚4-苯乙烯磺酸钠(PEDOT-PSS)离子-电子传导层；采用蘸涂法，制备了钙离子选择性微电极敏感膜。考察了电极的响应线性、选择性及重现性。结果表明:PEDOT-PSS传导层可提高钙离子选择性微电极电位稳定性；钙离子选择性微电极在钙离子活度范围为1.0×10~(-7)-5.4×10~(-3)M(S=31.4 m V/dec，R~2=0.992)内呈能斯特响应，检出限为6.3×10~(-8)M；此外，该电极对多种干扰离子具有良好的选择性，且重现性良好。


2.微参比电极的制备及表征微参比电极作为微检测系统的必要组成部分，其制备及性能至关重要。与传统材料烧结玻璃相比，琼脂糖凝胶具有热可逆性，在融化状态下可通过虹吸效应吸入毛细玻璃管，且可通过氢键连接形成网状结构。本研究以琼脂糖凝胶为盐桥，采用Ag/Ag Cl丝，制备了微参比电极(直径为8-10μm)，并考察了微参比电极的性能。结果表明:微参比电极在不同溶液浓度(10~(-5)M-10~(-1)M)和价态(一价或二价离子)的电解质溶液、不同p H(3-10)及不同比例(0.1-10)氧化还原物质Fe(CN)_6~(3-)/Fe(CN)_6~(4-)的溶液中均具有良好的电位稳定性。与现有的微参比电极相比，该微参比电极具有稳定性高、操作简单、易于小型化等优点。


3.钙离子选择性微电极检测毒死蜱作用下草履虫细胞膜表面钙离子吸收毒死蜱是一种被广泛使用的有机磷杀虫剂，它能够对天然水体中的生物系统造成危害。我们以草履虫为环境毒理评价模型，研究毒死蜱作用下草履虫细胞膜表面钙离子浓度的变化。本研究在上述制备的钙离子选择性微电极及微参比电极的基础上，结合倒置显微镜、微操作器等仪器，构建了电位型微电极单细胞毒理分析平台。通过钙离子选择性微电极原位检测草履虫细胞膜表面钙离子浓度的变化，研究毒死蜱对草履虫单细胞毒理效应。结果表明:草履虫在毒死蜱作用下，细胞膜表面钙离子通过钙离子通道开放被吸收，进而导致电位下降，草履虫对毒死蜱的敏感浓度为1-5μM。


4.铜离子选择性微电极的构建及在沉积物孔隙水分析中的应用对于沉积物孔隙水的检测，需要微电极具有一定的机械强度。因此，本研究采用金丝作为电极材料，采用火焰熔融法，制备了金微电极(直径为14μm)；通过电沉积PEDOT-PSS，修饰了传导层；将铜离子选择性聚合物膜蘸涂至修饰电极表面，制备得到全固态铜离子选择性微电极。对铜离子选择性微电极电化学性能以及电位响应特性进行了表征。在优化条件下，铜离子选择性微电极在0.5 M Na Cl背景溶液下对Cu~(2+)的能斯特响应活度范围为2.5×10~(-7)-2.5×10~(-4)M，检出限为4.0×10~(-8)M。该铜离子选择性微电极成功用于经预处理的沉积物孔隙水中Cu~(2+)的检测，且检测结果与阳极溶出伏安法一致。该微电极具有检测灵敏度高、所需样品体积较小(300微升)等优点。该全固态铜离子选择性微电极有望用于海岸带沉积物孔隙水中Cu~(2+)的原位检测。此外，该微电极制备方法可通过改变不同种类离子选择性膜，实现对沉积物孔隙水中其它重金属离子的检测。


5.铅离子选择性微电极的构建及在海岸带沉积物孔隙水原位检测中的应用我们制备了铅离子选择性微电极，以期实现孔隙水中铅离子的原位分析。本研究对铅离子选择性聚合物膜各组分组成比进行了优化，并对其电化学性能以及电位响应特性进行了表征。结果表明:所制备的全固态铅离子选择性微电极，在0.5 M Na Cl背景下，对Pb~(2+)的能斯特响应活度范围为2.1×10~(-9)-2.1×10~(-4)M Pb(NO_3)_2(S=28.1 m V/dec，R~2=0.999)，检出限为6.4×10~(-10)M。将铅离子选择性金微电极和微参比电极组成微电极检测体系，结合微操作器平台，在实验室条件下，实现了对所采集沉积物孔隙水中铅离子的垂直剖面原位检测。


6.基于全固态铜离子选择性微电极的计时电位分析法的构建游离态形式存在的重金属在海水重金属总量所占比例非常小，因此对电位检测电极的灵敏度和检出限均提出了较高的要求。实验表明，上述电位型微电极在部分孔隙水样品中难以实现重金属离子的检测。计时电位法的检出限和灵敏度均优于电位法，且可实现电极的可逆性使用。本论文在全固态离子选择性微电极研制的基础上，采用计时电位法，对重金属离子检测进行了研究。以铜离子检测为例，制备了全固态铜离子选择性微电极，并对施加电流大小、膜厚度等进行了优化。在最优条件下，铜离子选择性微电极对Cu~(2+)的活度线性范围为2.5×10~(-10)-2.5×10~(-7)M(S=60.1 m V/dec，R~2=0.996)，检出限为1.4×10~(-10)M。基于全固态离子选择性微电极的计时电位法有望用于海岸带沉积物孔隙水中重金属离子的原位高灵敏分析。