长期以来，人们一直对了解水包油型乳液中自由基引发的脂质自氧化作用的进展机理感兴趣。最初的自由基被认为主要是由乳液水相中的金属催化反应产生的，其中自由基向油滴表面移动，与界面附近的不饱和脂肪酸相互作用，并引发自由基链反应，最终散布在整个油滴中。BODIPY 676/665是一个亲脂性自由基敏感的荧光探针，可用于研究自由基驱动的脂质自氧化作用。在自由基引发剂二叔丁基过氧化物和2,2'-偶氮双（2,4-二甲基）戊腈（AMVN）存在下，研究了BODIPY 676/665的灵敏度。在这两种情况下，BODIPY 676/665的荧光在饱和中链甘油三酸酯油中的变化要比亚麻子或葵花籽油中的多，后者的高度不饱和度有望使自由基衍生的脂质氧化更加明显。BODIPY 676/665作为饱和油中唯一可用的可氧化物质，自由基直接攻击自由基，导致探针氧化的速率很高；而在不饱和油中，自由基攻击不饱和脂肪酸或BODIPY 676/665，导致探针速率降低氧化。共聚焦显微镜研究以BODIPY 676/665作为自由基敏感探针，结合水包油乳液混合物的耗氧量测量结果表明，自由基可以在油滴之间转移，从而在相邻的油滴之间扩散自由基驱动的氧化。


微呼吸系统对油水混合乳液中的氧的消耗速率的监测


使用克拉克型氧微呼吸电极（unisenses）实时监测乳液中的氧浓度变化情况。通过使用Unisense皮安表（Unisense PA2000，丹麦）记录氧浓度数据。具体操作过程如下：首先将需要研究的乳液样品转移到带有研磨玻璃塞子的2.7 mL玻璃容器中（微呼吸瓶），氧气微呼吸电极穿过玻璃塞中心然后将其置于37°C的水浴中。Unisense微呼吸系统可每隔30秒记录一次微呼吸瓶内氧的浓度（Unisense PA2000），记录一段时间内的氧浓度的值的变化情况，并将其自动绘制为随时间变化的氧气浓度变化的函数图，获得的耗氧曲线的线性部分可用于确定该时间段内的氧的消耗速率。研究的样品包括MCT油乳液、SFO乳液、含有BODIPY 665/676的SFO乳液、MCT油和SFO以重量比3：7或7：3混合的混合油乳液。


实验结果


使用BODIPY 676/665通过荧光法和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对散装不饱和油和不饱和水包油型乳剂进行自由基检测。通过使用不同乳液的组合来进行测试研究的，其中相邻的油滴具有不同的组成，因此可以在微观尺度上研究自由基在不同油滴之间的转移和氧化。基于荧光的研究与电子自旋共振（ESR）光谱相辅相成，用于检测自由基相关的反应，并耗氧以监测乳液中脂质氧化的总体程度。

图1、（□，■）MCT油和（○，●）LSO中BODIPY 665/676的荧光强度变化。这些油中包含DTBP（5.7μM）和BODIPY 665/676（1μM），并用300 nm紫外线灯照射。（A）在λex 580 nm处（实心符号）测量荧光强度，（B）在λex=670 nm处（实心符号）测量荧光强度。

图2、MCT油和SFO混合物中自旋加合物的形成速率。油共混物样品包含自旋阱PBN（20 mM）和自由基引发剂AMVN（6 mM），并在37°C下加热。自旋加合物的形成速率计算为通过ESR检测的自旋加合物信号随加热时间的增加，并报告为油共混物中MCT油的重量百分比的函数。（□）不同浓度的MCT油和SFO的混合物；（▲）90 wt％的MCT油和10 wt％的亚油酸甲酯的混合物。

图3、用混合油和各种浓度的添加的AMVN在37°C下测得的Tween-20稳定乳液的耗氧率，以每分钟耗氧百分比表示。实心条：30 wt％MCT油和70 wt％SFO的混合物。空心棒：70重量％MCT和30重量％SFO的混合物。


总结


研究人员主要应用BODIPY 665/676这种有用的亲脂性荧光探针，用于检测和研究散装油和水包油乳液中的自由基反应。由于自由基的结构会显着影响荧光强度变化的水平，而BODIPY 665/676强度变化的低水平不能直接解释为脂质氧化的低水平。研究人员通过共聚焦激光扫描显微镜以BODIPY 665/676作为荧光探针对混合乳状液进行研究，辅以通过unisense的微呼吸系统对混合乳状液的耗氧量进行了相关测试，unisense氧气微呼吸电极能够监测在微呼吸瓶内乳液样品中的微小的氧浓度变化，通过获得的耗氧速率来监测乳液中脂质氧化的总体程度，研究人员提出的自由基能够通过转运机制或扩散而在油滴之间移动的假说的机制是通过使用unisense微呼吸系统确定乳液混合物中的耗氧速率得到了重要的数据支持，这说明unisense微呼吸系统可以应用于油脂乳液体系中氧化机制的研究。