甲烷是重要的化工原料和化学能源，在人类的生产生活中扮演着重要的作用，但是甲烷又是地球大气中仅次于二氧化碳的第二号温室气体。甲烷引起的室效应是同等质量二氧化碳的20~30倍。甲烷氧化菌是以甲烷作为生长的唯一碳源和能源的微生物。广泛存在于泥土、沼泽、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。甲烷氧化菌在温室气体控制（吸收甲烷）、环境保护和工业生物催化中的重要地位，世界各国的科研机构对甲烷氧化菌及其相关酶系的研究日益增多。本论文分离出一种疣微菌门甲烷氧化菌，通过基因编码解析出这类甲烷氧化菌的基因，并且研究该类甲烷氧化菌是如何应用地热能源中的氢气和甲烷实现异养和自养生长的。


Unisense微电极系统的应用


在生物反应器中应用了unisense氧气微电极和氢气微电极测试了甲烷氧化菌生长时，体系中的氢气和氧化的消耗情况。其中体系中的氢气和氧气的浓度消耗是直接将氧微电极或氧微电极是直接插入细胞培养液环境中测试完成的。其中微电极的矫正采用了两点法完成的。


实验结果


研究发现疣微菌门甲烷氧化菌的生长是基于混合营养体法，该甲烷氧化菌是从酸性地热田土壤中分离获得疣微菌门甲烷氧化菌RTK17.1菌株，该类菌株含有氧化氢气的酶结构，通过基因组分析证实，这种菌株编码了两种[NiFe]-氢化酶，生化试验表明该菌能够利用氢作为有氧呼吸和碳固定过程中的电子供体进行生长。这类甲烷氧化菌生长是够通过在地热资源中利用氢和甲烷来满足能量和碳的需求，并且其所需的营养液是动态变化的，这也说明了这种混合营养的生活方式很可能促进了这些微生物所占据的生态位空间的扩展，导致它们在地热影响表层土壤中分布较多。

图1、新西兰地热田中甲烷、氢气氧化的地球化学、生化和分子特征。图a)表示的是不同温度下，不同深度土壤的温度和pHf分布情况。图b表示的是土壤不同深度处甲烷、氢气和氧气混合比例。图c表示的是不同温度下，土壤表面甲烷氧化过程随时间的变化过程。图d表示的是不同温度下，土壤表面氢气氧化随时间变化的过程。图e表示的是不同土壤深度下甲烷氧化菌的种群结构分布情况。图f表示的是不同深度下土壤中疣微菌门甲氧化菌的基因编码分布情况，具体指的是中疣微菌门甲氧化菌中有氧吸收氢化酶和颗粒状甲烷单加氧酶的分布情况。

图2、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）的氢气氧化驱动的需氧呼吸及二氧化碳固定过程，图a表示的是使用细胞生物氧化器培养细胞过程中的氢气实时氧化过程速率图。其中体系中的氢气的实时监测是使用了unisense公司的氢气微电极测试完成的，图b表示的是细胞膜中氢化酶的活性监测。图c表示的是细胞需氧呼吸过程中对氢气的依赖，其中对于氢气浓度的实时监测主要是基于未进行任何处理的细胞和经过尼日尼亚菌素处理的细胞。图d表示的是基于未进行任何处理的细胞和经过尼日尼亚菌素处理的细胞的氢气的氧化速率。图e表示的是分批的全细胞培养过程中的二氧化碳的固定。

图3、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）在氢气存在条件下进行批培养下混养生长和自养生长情况。图a表示的是甲烷氧化菌在混合营养条件下和自养条件下的生长期情况。图b表示的是混合营养生长条件下的甲烷氧化速率，以及使用了颗粒甲烷单加酶抑制剂乙炔处理后的混合营养生长条件下的甲烷氧化速率。图c表示的氢气的氧化速率变化情况。图d表示的是嗜酸的甲烷氧化菌株在有氢气条件存在以及无氢气环境下的生长情况对比。

图4、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）对于甲烷和氢气的既定氧化。其中细胞是使用静态间歇式生物反应器在50摄氏度下反应培养的，其中固定相培养环境顶部空间使用的是氮气中充入不同浓度的二氧化碳、氢气、甲烷等气体。其中图a表示的是氮气中充入了19%CO2,20%O2,、9%H2，体系中的甲烷、氢气、氧气的随时间的变化情况。。图b表示氮气中充入9%H2、9%CH4体系中的甲烷、氢气、氧气的随时间的变化情况。图c表示的是甲烷存在或氢气存在的条件下，加入10%的氮气后，体系中的甲烷、氢气、氧气的随时间的变化情况。

图5、嗜酸的甲烷氧化菌株（sp.RTK17.1）的甲烷和氢气的氧化模型示意图。从图中可以看出该菌在进行混合营养生长时，氢气和甲烷的氧化都生产出同等当量的还原产物对苯二酚（QH2），其中的大量的氢质子转移动力是基于氢质子改变为F1F0-ATP和酶产生的的足够量的ATP能量。对苯二酚则是通过氢气氧化提供的电子用于甲烷单甲氧化酶的催化产生的。NADH的还原则是基于甲酸脱氢酶以及氢气依赖官能团[NiFe]-氢化酶的作用通过卡尔文循环去固定二氧化碳实现的。


总结


本论文从地热型酸性土壤中发现了一株全新的甲烷氧化细菌Verrucomicrobia。这株细菌不同于已知的甲烷氧化菌，可以在高度酸性（pH2.0-2.5）的环境中生长，并且分类上与现有的甲烷利用细菌（Methanotroph）属于不同的门。研究发现，该菌含有新型甲烷单加氧酶，利用一种独特途径同化甲烷，同时能够利用氢作为有氧呼吸和碳固定过程中的电子供体进行生长，该菌能够能够利用有机物或甲烷作为碳源生长，研究过程中使用了unisense的氢气微电极和氧微电极正确的测试了进行甲烷氧化细菌培养生长过程中的氢气和氧气的浓度分布情况，研究表面当细胞培养器氧化亚氮和氧剖面浓度分布情况，从而了解到这类甲烷氧化菌的生长机制，首次提出了甲烷氧化菌能够通过对氢的氧化获取生长的能源，该机理的提出也拓宽了今后甲烷氧化细菌生态学领域的研究。