深海水域的微生物氧呼吸具有重要的生态学意义，但人们对其研究甚少，主要是方法上的困难较多。尤其是微生物的呼吸测量是具有挑战性的，因为需要高分辨率的氧气浓度测量设备。最近关于氧传感技术（丹麦unisense研发的微电极技术）的改进克服当下研究这些问题的局限性具有很大的潜力。本论文的研究人员主要比较了三种不同的方法来测量低氧浓度下的耗氧量，利用克拉克型氧传感器(STOX)，光学氧传感器(optodes)，质谱结合18-18O2标记法。研究人员通过在不同的方法中，以及同样的实验设置中，对比研究三种方法的氧浓度和耗氧量一致性评价，并采用高耗氧量法测定了30-400 nmol L-1h-1的耗氧量精度及相对标准误差。


Unisense微电极测量系统的的应用


unisense公司的氧气微电极(STOX)应用于水生生物的氧的消耗及消耗速率的测试。STOX氧气微电极采用传统的两点法进行矫正，研究过程中将STOX型微电极插入到特制的玻璃瓶中，测试玻璃品的水生生物的耗氧速率，并同步采用光学氧传感法及质谱法测试含有水生生物的玻璃瓶中的氧的消耗速率。


实验结果


研究发现所有方法均适用于O2消耗量的检测，反应速率在几个nmol L-1h-1和低浓度O2的范围内，研究结果测试出了海洋环境下的海洋生物预期的氧的消耗速率。其中氧的消耗速率的具体限制需要控制如微电极传感器的漂移(STOX)和氧的污染(Exetainer)的最小化以达到低检测限，并充分利用传感器带来的特定精度和测量频率。潜在检测限为24小时潜伏期为几个nmol L-1h-1或更少，但各有差异的方法。对于连续测量和极低的氧消耗速率，推荐使用STOX传感器（unisense微电极）和光电法。研究发现在低氧浓度下培养是一个特殊的挑战，比如聚集体的存在是否可以限制扩散速率预期浓度低于20umol L-1，并要考虑有限的氧气消耗的本身扩散，样品需要更加精细化的处理，以便更好地在原位条件下繁殖并考虑到其聚合体的大小和分布。

图1、实验培养装置图。孵育瓶置于恒温水浴中。两个光学氧传感器被放置在瓶的上半部分相对的两侧。该STOX传感器是通过一个玻璃管插入瓶的中心。校正的过程是通过压力补偿口加入已知的空气饱和量的水。容器下方通过磁力搅拌器旋转。

图2、水培养瓶用18O2标记。标记的水以0.73 mL min-1的流量泵出瓶子的薄膜入口穿过质谱仪。水是通过一个气密袋中脱去无标记氧的水后定位在上边缘的压力进入取而代之。氦气作为载体气体，具有质量稳定、速度快的特点。

图3、实验1:光学氧传感器和全量程光学氧传感器(全范围)和STOX传感器测试体系中的氧浓度的示意图。脱气水依次富集，通过加入已知体积的饱和空气水(箭头)来补充氧气。消耗率计算后，增加的O2随时间减少。30小时后加入ZnCl2停止生物活性。插图表示的是在最初几个小时内的光电子初始适应情况。

图4、对比几种测试方法氧气随时间的变化情况。实验结束后用光电子和STOX传感器测量氧气消耗速率，调节O2浓度为1.2 umol L-1(A)、5.5 umol L-1(B)、umol L-1(C)，加入20ml ZnCl2后图(D)，线性拟合用直线表示。其中时间和浓度轴的纵横比(umol L-1 h-1)对于所有允许的图形都是相同的坡度上进行比较的。

图5、比较膜入口质谱法（MIMS）和安培电流法（STOX）传感器（unisense氧微电极）。O2的浓度和消耗率测量后，添加1.2 umol 18-18O2 L-1(图A箭头所示.单个MIMS法的测量值(灰色点)取平均值(黑点)，并用相应的点表示标准差。整个实验运行3小时同时测量。(B)用于氧的消耗速率计算。

表1、三种不同方式测量的氧的耗速率、方法设置和统计。表1中总结了不同O2浓度(O2)、不同传感器和采样频率下测量的O2消耗耗率。由式(1)和式(2)计算各速率测量值、标准差(SE)和残差均方根(RMSRES)及潜在的检出率极限，假设培养24小时由公式3计算。请注意较低的RMSRES表示较高的精度和潜在的速率检测限制只基于精度和测量频率，而不考虑传感器漂移或O2污染带来的可能限制。

图6、耗氧速率与O2浓度的关系。实验1、实验2、实验3的耗氧量被总结并绘制在各自孵育的初始O2浓度上。实验3中的虚线表示由公式4估算出的扩散极限速率，假设总直径(r0)为0.14 mm。其中实验1的获得的氧消耗速率也随着培养时间的增加而增加，同时也能反映细菌随时间的增长。

表2、不同测试方法在精度、检出限和适用性方面进行比较图。表中的评级方案采用符号表示:正常(+)、强(++)和非常强(+++)。同时比较了传感器的易损性、现场操作性和易损件的价格对比情况。


总结


由于深海属于的微生物的氧呼吸具有重要的生态学意义，因此研究人员需要找到一种测试方法能够准确的测试出深海水域的微生物的呼吸速率，由于微生物的氧呼吸的浓度特别低，因此需要具有高分辨率的氧浓度测试设备，并且其检测限能够达到nmol/L，这对于设备的要求非常高，而丹麦unisense公司开发的氧微电极能够很好的完成这些测试，研究人员为了能够获得海水中微生物的氧的消耗速率的准确性，同步使用了光学氧传感器以及质谱法来同步验证，对于连续测量和极低的氧消耗速率，推荐使用STOX传感器（unisense微电极）和光学氧传感器，而相比于光学氧传感器，STOX传感器的使用成本较低，非常适合研究人员应用与微生物的氧消耗测试，并且相比于其他方法，也具有较高的精度，尤其是在低氧浓度下培养的微生物的呼吸速率的测试，因为这些微生物的聚集体的存在是存在一定的扩散速率，需要考虑的扩散限制氧气消耗情况，而unisense微电极具有测试速度响应快、受氧气扩散消耗的影响小等优点，可以在原位条件实现对微生物的氧呼吸速率的测试，这也说明unisense微电极在低氧浓度的海洋环境中的水生生物的呼吸速率的测试具有非常好的应用前景。