间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有高度增殖、自我更新能力，广泛分布于骨髓、脐带血、脐带、胎盘、脂肪、外周血及肌肉等各种组织中。Exosomes中义名称为外来体或外泌体，是一种脂质分子膜包裹的小囊泡，是胞外囊泡（exracellular vesicles）的一种，外泌体中包裹多种活性分子，如活性蛋白、RNAs（IncRNA、mcroRNA.、mRNA等）及DNA等。干细胞的外泌体可以对组织进行损伤修复、抑制炎症反应、调节免疫系统等，目前被研究于多种疾病模型中，如减少心肌梗死的面积，促进肾脏的损伤修复，调节免疫应答等。本论文主要就早产新生儿脐带内分离获得的间充值干细胞外泌体的相关性质进行研究，研究这类细胞外泌体进行。


微电极的应用


使用了unisense的微电极测试了MSC外泌体细胞的氧气呼吸速率情况。在测试细胞的氧气消耗前，所应用的电极经过矫正平衡，并获得标准曲线，其中细胞的呼吸速率是以nmmol/min/mg单位表示。


实验结果


间充值干细胞（MSCs）是干细胞家族的重要成员，具有高度增殖、自我更新能力、广泛分布于骨髓、脐带血、脐带、胎盘、脂肪、外周血及肌肉等各种组织中。本论文研究分析早产儿与足月儿脐血分离的间充质干细胞外泌体的氧化磷酸化性能是应用流式细胞仪、免疫印迹法、血样定量法和荧光分析法进行鉴定的。在使用Unisense微电极系统测试MSCs外泌体线粒体呼吸链复合物表达过程中的氧气消耗情况时候发现，ATP合成酶能够在足月新生儿的脐带提取MSC外泌体中检测到。MSC外泌体在不需要线粒体的情况下具有特定的有氧呼吸能力。

图1、流式细胞仪检测足月儿和早产儿的UCB-MSCs表面标记。其中的MSC细胞是足月新生儿胚胎提取的间质干细胞（MSC）和早产新生儿胚胎提取的间质干细胞。从图中可以看出，不论是足月的还是早产儿脐带提取的MSC细胞表面对CD73、CD105、CD90等表达特异性标志物均表现为阳性，而对于CD41、CD 34、CD14均呈现阴性，这说明表达了典型间充质干细胞标记CD73、CD90和CD105，均不表达造血干细胞标记CD34，CD45、CD14。

图2、从UC MSC实验中分离出足月和早产儿脐带提取的干细胞的外泌体的氧化磷酸化性质研究。图A、B指的是正常脐带提取的干细胞外泌体以及早产儿脐带提取的干细胞外泌体的氧消耗分析。这两组细胞外泌体的呼吸作用会随着NADH以及琥珀酸盐的加入而增强，而鱼藤酮和抗酶素的加入会抑制其细胞的呼吸。其中的氧气消耗是以umol为单位。图C表示的是对比MSC线粒体（白色空心柱）、早产新生儿脐带提取MSC外泌体（灰色柱）、正常新生儿脐带提取MSC外泌体（淡灰色柱）、使用尼日利亚菌素处理过的早产新生儿脐带提取MSC外泌体（斜线柱）、使用尼日利亚菌素处理过的正常新生儿脐带提取MSC外泌体（黑色柱）的呼吸速率，其中的氧气呼吸速率的单位是nmol O/min/mg。图D指的是这些细胞线粒体在进行正常呼吸代谢时的ATP生产对比。图E指的是MSC线粒体、正常新生儿脐带提取MSC外泌体线粒体以及早产新生儿脐带提取MSC外泌体线粒体进行呼吸代谢过程的电子转移情况分析。上述实验，每组数据都是测试5次获得的平均数据。

图3、蛋白的氧化磷酸化表达评价，采用了免疫印迹法。图A指的是使用免疫印迹法（WB）分析ATP的合成酶以及来自于早产儿和正常足月新生儿脐带分离获得的MSC外泌体细胞中线粒体呼吸链复合物的凝胶电泳图像分析。图B表示的是上述外泌体中线粒体呼吸链复合物（NADH-Q氧化还原媒（也称为复合物I）、细胞色素C氧化酶（也称为复合物IV）ATPase(ATP合成酶复合物V)）表达的密度分析。图C指的是二维细胞培养法获得的正常新生儿脐带提取的外泌体的二维凝胶电泳图像（经过银染色）。图D指的是使用红色染色后的外泌体膜外的表面蛋白表达的二维凝胶电泳图像。图E指的是免疫印迹法分析ATP合成酶的β-表面蛋白抗体分析的凝胶电泳图像。


总结


人脐血是指脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，研究显示其除含有丰富的造血干细胞外，还含有其他的干/祖细胞，包括间充质干细胞、内皮祖细胞等。本论文研究了间充值干细胞外泌体的相关性质。通过对早产儿与足月儿脐带血提取分离获得相应的间充质干细胞外泌体。脐带间充质干细胞来源的外泌体可以通过改善氧化应激反应及抑制凋亡而保护肾脏免受四氯化碳诱导的损伤。干细胞来源的exosomes在组织重建上起到了很重要的作用，其在再生医学方面得到了广泛的实验研究。本论文应用了流式细胞仪分析外泌体细胞进行了UCB-MSC表面标记，并且应用Unisense微电极系统测试了外泌体在进行氧化磷酸化过程中的线粒体呼吸链酶电子转移过程中的氧气消耗情况，从而得出了MSC外泌体在没有线粒体的情况下也能进行有氧代谢，这也进一步说明了，使用微电极系统可以很好的发挥MSC干细胞外泌体在治疗组织损伤、皮肤修复、神经系统疾病方面存在着广泛的应用。