材料和方法


地下水源和特征


在ONKALO隧道中，在387.9 m深度处钻了一个直径为76 mm的钻孔，表示为ONK-KR15（Toropainen 2011)。钻孔于2011年2月23-28日以8.6°的倾角进行，总长度为79.96 m。无金属封隔器系统将钻孔中的含水层与隧道岩面75.0–75.2 m处的深度399 m隔离；含水层的透射率为7.6×10-9 m 2 s-1。地下水被这个封隔器系统引导到下面描述的FC，然后通过两个平行的1/8英寸聚醚醚酮(PEEK)高压液相色谱质量(IDEX Health and Science,Oak Harbor,华盛顿州，美国）。封隔器系统中示出了图1和在别处详细（Pedersen的描述2005）。该系统通过使用6毫米不锈钢管来屏蔽暴露在空气中的钻孔部分中的PEEK管。地下水的第二个来源是一个76毫米直径的钻孔，表示为ONK-PVA6，在ONKALO隧道中钻探的深度为318.7 m（Toropainen 2009）。钻孔于2009年11月3-4日以14.8°的倾角进行，总长度为35.15 m。无金属封隔器系统将钻孔中的含水层与327 m深度的隧道岩面隔离32.7-32.9 m。用于化学分析的地下水样品于2012年4月12日从这些钻孔中收集并立即运送到Teollisuuden Voima，在那里根据内部协议进行化学分析或分包给外部实验室，如别处详细描述的（补充表3 Pedersen等人的。2008）。


表1试验地下水地球化学参数及各参数对比

表2.2012年1月11日采样的ONK-KR15地下水、2012年4月17日采样的用于填充流通池循环系统的ONK-KR15地下水和ONK-PVA6地下水中溶解气体的浓度

表3 2012年1月11日钻孔ONK-KR15和2012年4月17日钻孔ONK-PVA6的地下水中最可能的可培养微生物数和细胞总数；SD=标准差，n=观察次数

图1.实验系统的图像。(a)用于隔离含水层的封隔器系统，流动池(FC)与碎石相连。(b)FC以四对四的方式串联安装在地下，安装在带有流量计和泵的机架中。地下水从孤立的含水层通过FC循环并返回含水层70天。然后将FC断开并转移到(c)实验室中的温度控制流通池循环系统。

用于现场工作的FC系统


三个相同的FC现场系统，每个系统包括四个FC，一个微型泵（Micropump GAH，带有PEEK叶轮的V21 J系列；Labinet，哥德堡，瑞典），两个压力计（S-11，40 Bar 4–20 G1/2；WIKA–AB瑞典语INDUSTRI仪器，瑞典哥德堡），流量计（50 PROMAG;E+H公司Flowtech AG，索伦蒂纳，瑞典）和4-L膨胀容器（彼得森2005）被安装在一处放置在ONKALO隧道的容器387 m深度并连接到ONK-KR15中的封隔器系统（图1）。每个FC由内衬聚二氟乙烯(PVDF)塑料的钢管（长300毫米，直径65毫米）组成。每个FC还有一个120毫米长的PVDF插件，带有一个22×32毫米的开口，支持110克碎石颗粒，提供大约850厘米的岩石表面积2假设平均直径为3毫米的球形岩石颗粒，微生物粘附和生物膜形成每FC个。


岩石颗粒经过热灭菌（160°C 5小时），取自ONK-KR15钻孔的钻孔核心，位于相交含水层的大致位置。在所述插入件的每个端部三个流动稳定确保水通过每个FC（Pedersen的均匀分布的缓慢的层流1982）。FCs于2012年2月7日安装。地下水循环在原位3.2 MPa的压力下以22-25 mL min的流速在含水层中70天-1。三个现场系统中循环的地下水总量分别为2562、2381和2287 L，由流量计记录。


生长实验的配置


将暴露于ONK-KR15地下水70 d的12个FC在压力下从ONKALO隧道运输到瑞典Mölnlycke的实验室，并且在三个流动池循环系统(FCCS)中的每一个中安装了四个重复的FC，从而得到总共三种治疗可能性（图1）。然后按如下方式添加硫酸盐和ONK-PVA6地下水：在室温（RT，20°C）下填充三个内衬聚四氟乙烯的500-mL不锈钢钢瓶（304L-HDF4-500-T；Swagelok，Göteborg，Sweden）包括：1)500 mL ONK-KR15地下水，2)5 mmol Na 2 SO 4溶解在500 mL ONK-KR15地下水中，以及3)5 mmol Na 2 SO 4溶解在500 mL ONK-PVA6地下水中。每个钢瓶与一个FCCS中的循环地下水连接，导致每个FCCS的总循环量为5500 mL。


这些处理在下文中表示为对照、硫酸盐和硫酸盐+ONK-PVA6。这些地下水循环的开始日期是2012年4月26日，结束日期是2012年8月7日，实验持续时间为103天。流速保持在22-25 mL min-1，对应于上大约1 mm s的流量-1岩石颗粒。四个耐压微传感器E h电极对，配备一个尖端直径为400-600μm的铂微电极（RD500；Unisense A/S，奥尔胡斯，丹麦）和一个尖端直径为90微米的Ag/AgCl参比电极–110μm的凝胶稳定电解质（REF100；Unisense）安装在每个FCCS中。电极代表了安装在不锈钢流通池中的标准玻璃Unisense微传感器的改进。电极连接到两个八通道mV放大器，这些放大器将记录的电压转换为数字信号，随后使用SensorTrace Basic软件（1.9版；Unisense A/S）每600秒收集一次并存储在Microsoft Office Excel文件中。


完整采样进行了六次，即在第0、7、19、40、61、82和103天，用于如下所述的分析。每次采样时，排出和排放循环水20 mL；将两个25-mL体积的水收集在无菌的50-mL聚丙烯(PP)管（Sarstedt，Landskrona，瑞典）中并深度冷冻直至进行硫酸盐分析，然后将10mL的水收集在一个15-mL的无菌PP管中以立即使用ATP分析。使用注射器在带丁基橡胶塞的厌氧玻璃管（编号2048-00150；Bellco Glass,Vineland,NJ,USA）中收集六份10 mL的水用于MPN分析，并收集10 mL用于CHAB分析。将两个10 mL体积的水收集在PP管中，用0.02μm过滤、中和的甲醛保存至最终浓度为2.5%，并分别分析TNC和VLP。此后，对9 mL水取样进行硫化物分析，并使用0.2μm注射式过滤器（Minisart，Sartorius注射式过滤器，亲水性；Fisher Scientific，Göteborg，Sweden）对两个5 mL体积的水取样并储存在-20°C直到可以进行乙酸盐和乳酸盐分析。


接下来，使用0.2-μm注射器过滤器(Minisart)对25 mL水进行采样，用于立即分析亚铁。使用0.2-μm注射器过滤器(Minisart)对两个10-mL体积的水进行采样并深度冷冻直至进行DOC分析。最后，收集10 mL地下水用于pH分析，收集100 mL地下水用于气体分析。在每次采样时，总共采集了334 mL的水。在第0天和第103天对水进行采样后，从每个FCCS中的两个FC中的每一个中收集了一批岩石颗粒，用于随后分析附着的ATP量和16S rDNA多样性。


乙酸盐、乳酸盐、有机碳、亚铁、硫酸盐和硫化物分析和pH值


使用酶促UV方法（用于乙酸盐的试剂盒编号10148261035和用于乳酸盐的试剂盒编号10139084035；Boehringer Mannheim/R-Biopharm AG，达姆施塔特，德国）使用Genesys 10UV分光光度计（Waltham Fisher Scientific，Waltham Fisher Scientific）测定乙酸盐和乳酸盐浓度,MA,USA)进行检测。用于溶解有机碳(DOC)分析的样品在分析前稀释1-100倍以获得最佳分析浓度范围。25 mL样品通过0.2-μm亲水注射器过滤器(Minisart)过滤并在-20°C下深度冷冻，直到根据CSN EN 1484方法在ALS Scandinavia AB（Täby，瑞典）进行分析。不确定度为分析值的±20%。使用SulfaVer 4方法（方法编号8051，程序680；HACH Lange AB；范围0.03–0.73mM，分布的95%置信限为±10%）分析硫酸盐。使用比色亚甲蓝方法分析硫化物，不确定度为±17%（瑞典标准方法SIS 028115）。使用1-10菲咯啉方法（方法编号8146，程序255，范围0.4-54 mM，分布的95%置信限为±11%；HACH Lange AB，斯德哥尔摩，瑞典）测定亚铁浓度。在从FCCS中提取后立即测定5-mL子样品的pH值，使用Schott CG84310 pH计（Schott AG，Mainz，德国），配备根据制造商说明校准的BlueLine 13 pH电极（VWR，斯德哥尔摩，瑞典）.


ATP分析


ATP生物质试剂盒HS（编号266–311；BioThema，Handen，斯德哥尔摩）用于测定地下水中细胞的总ATP。这里使用的ATP的生物量的方法进行了说明，在细节测试和评估为使用芬诺斯堪底亚盾地下水（Eydal和Pedersen 2007）。该方法也用于附着在岩石颗粒上的生物质，但进行了以下修改：从每个FCCS的两个FC中的每一个中取样大约10个岩石颗粒，并将其置于ATP提取溶液中并进行分析。


跨国公司和VLP


的TNC mL-1使用Hobbie等人设计的吖啶橙直接计数法测定10 mL样品中。（1977年）和由彼得森和Ekendahl（改性1990）。使用与SYBR金（分子探针，Eugene，OR，USA）直接计数法根据高贵富尔曼（确定VLP的总人数1998年）。


气体采样和分析


使用压力容器如其他地方所述，收集水样品（Hallbeck和Pedersen 2008）。将样品转移到真空容器中，在室温下真空（即水蒸气压）蒸发掉水中的任何气体；转移时间约为20-30分钟。提取后，气体被压缩并转移到10毫升注射器（SGE Analytical Science，墨尔本，维多利亚，澳大利亚），并测量提取的气体和水的体积。随后将捕获的气体转移到一个6.6毫升的玻璃小瓶中，小瓶用丁基橡胶塞塞住，并用铝卷边密封。小瓶先前已被抽真空并用N冲洗两次2，并在高真空(1 Pa)下放置。添加硅胶脱水剂以吸附气体中残留的任何痕量水。然后使用气相色谱进行分析。


使用和配备了两种不同的色谱仪，如下所示。H 2(<20 ppm)Ar和CO 2在配备CP7355 PoraBOND Q 50 m×0.53 mm ID色谱柱、CP7536 MOLSIEVE 5A PLOT 25 m×0.32 mm ID色谱柱和脉冲放电色谱柱的Bruker 450气相色谱仪上进行分析氦离子化检测器(PDHID)(Bruker Daltonics Scandinavia AB,Solna,Sweden)。He和N 2在Varian Star 3400CX气相色谱仪（Varian Analytical Instruments，Varian AB，Bromma，Sweden）上使用热导检测器进行分析，柱温检测器、检测器和灯丝温度分别为65、120和250°C。气体使用Porapak-Q色谱柱（2 m×1/8英寸直径；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA）和分子筛5A色谱柱（6 m×1/8英寸；Sigma-Aldrich)以氩气为载气。CH 4、C 2 H 6和CO在Varian Star 3400CX气相色谱仪(Varian Analytical Instruments)上使用火焰离子化检测器(FID)以65℃的烘箱温度和200℃的检测器温度进行分析。使用Porapak-Q色谱柱（2 m×1/8英寸直径；Sigma-Aldrich）分离气体，并在FID上用N 2作为载气。


栽培介质


培养基为CHAB制备和NRB，IRB，MRB，SRB，AA，和AM的最可能的号码分析如别处所描述（Hallbeck和Pedersen 2008）。培养时间约为8周，以确保结果中包含生长缓慢的微生物。


从MPN培养物、地下水和生物膜中提取DNA


根据制造商的方案，使用MO BIO PowerWater DNA分离试剂盒（目录号12888）从地下水和最可能数(MPN)培养物中提取总基因组DNA，使用MO BIO PowerBiofilm DNA分离试剂盒从附着在岩石颗粒上的生物质中提取（目录号24000–50），均来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的MO BIO实验室。本工作中使用的MO BIO提取试剂盒的提取体积为100μL。


使用配备PowerWater套件过滤器单元（MO BIO Laboratories）的水过滤器的高压不锈钢47毫米过滤器支架（X4504700；Millipore AB，Solna，Sweden）对地下水进行压力过滤。过滤器支架配备了减压阀（Swagelok SS-RL3S6MM；SWAFAB，Sollentuna，瑞典）和压力计，能够相对于环境含水层压力在200到400 kPa之间调节过滤器的压降。0.05–0.2 L min的流速-1 2012年4月17日，从ONK-PVA6和ONK-KR15隧道钻孔中以过滤地下水。ONK-KR15中高渗透性含水层的地下水过滤体积约为57 L ONK-PVA6中的低渗透含水层为14 L。


从选定的MPN培养物中，使用真空抽吸将9 mL培养物过滤到0.22-μm滤水器（目录号14880-100-WF；MO BIO Laboratories）上。使用无菌、无DNA的镊子，在第0天从三个FCCS中的每一个中收集40个岩粒并汇集（2克岩石），并在第0天从每个FCCS中收集80个岩粒并汇集（4克岩石）103;这些岩石颗粒直接放入制造商提供的空生物膜DNA提取容器中。


使用ND-1000紫外可见分光光度计（Nanodrop Technologies，Wilmington，DE，USA）测量总提取的核苷酸浓度，并使用带有MXPro软件的Stratagene MX3005p荧光计（Agilent Technologies，Santa Clara,CA,USA)和Quant-it Picogreen试剂盒（目录号P7589；Molecular Probes），根据制造商的规格。提取的DNA保存在-20°C，随后用于测序。


MPN培养物的克隆和16S rDNA测序


MPN培养微生物的物种多样性通过其细菌16S rDNA序列来衡量。PCR扩增中使用的通用的16S rDNA正向和反向引物27F和1492R，分别（泳道1991）。热循环条件为98°C 30 s、98°C 30 s、60°C 30 s和72°C 30 s 30个循环，最终72°C 5 min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外光照射。然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒（目录号28704；QIAGEN，Solna，瑞典）按照制造商的方案纯化扩增产物。为了产生平端iProof聚合酶产物的3´A突出端，将1μL Taq聚合酶（目录号18038-042；Molecular Probes）和额外的dATP添加到反应混合物中，然后在72°C。


将纯化的样品克隆到线性化PCR 2.1-TOPO载体中，并转化到化学感受态TOP10´F大肠杆菌使用TOPO TA克隆试剂盒（目录号K4550-01；Molecular Probes）按照制造商的方案细胞中。随机选择含有插入物的白色克隆，并将每个菌落接种到含有卡那霉素（40 mg mL LB琼脂平板上，-1）的并在37°C温育过夜。提取重组质粒，随后使用Value Read Plate service（Eurofins MWG Operon，Ebersberg，Germany）和M13rev(-29)测序引物（5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´）和M13uni(-21)测序引物进行测序(5´-TGT AAAACGACGGCCAGT-3´)由Eurofins MWG提供，用于16S rDNA克隆的Value Read Plate服务。


原始数据序列进行筛选使用Bellerophon的程序（Huber等人的嵌合序列。2004年）。使用Geneious 6.0.3软件包（Biomatters，奥克兰，新西兰）分析和比对序列数据。的16S rDNA的参考基因的大肠杆菌布罗修斯与登录号J01695用作用于对准的序列掩模的16S rDNA克隆（Huber等人。2004年）。此外，将克隆与BLAST核苷酸数据库中可用的序列进行比较。使用核苷酸-核苷酸算法或16S rDNA微生物算法分析序列同源性。与数据库记录相似度<99.9%的序列以登录号KC676781到KC676786提交到GenBank数据库。


454来自地下水和FC生物膜的DNA的Pyrotag测序、处理和分析


针对细菌16S rDNA v4v6区域的简并正向518F(5´-CCAGCAGCYGCGGTAA-3´)和反向1064R(5´-CGACRRCCATGCANCACCT-3´)引物用于在454 Roche GS-FLX系统(454 Life Sciences,Branford,CT,USA)使用Roche Titanium协议生成读数，作为深度生命普查计划的一部分(http://www.deepcarbon.net/content/deep-life)。每次读取的开头和结尾都针对引物碱基进行修剪，并删除基于热标签测序错误率评估的可能低质量的序列（Huse等人2007）。使用序列分类的全局比对(GAST)标签映射方法（Sogin等人2006），其中16S rDNA序列，RefSSU，参考数据库是基于席尔瓦数据库（Pruesse等人。2007）。如果三分之二或更多的全长序列共享相同的指定操作分类单元(OTU)，则将标签分配给该OTU。根据BLAST与任何参考标签不匹配的标签不会被赋予分类学分配。


方法论和图书馆建设的更多细节可以在别处找到（Marteinsson et al.2013）。通过稀疏分析测试序列的代表性，并使用Chao指数估计OTU丰富度。为了统计估计每个样品的丰度和均匀度，计算了香农指数和辛普森指数。使用Morsita-Horn算法进行序列相似性的距离计算。生成的数据已提交给NCBI序列读取存档(SRA)，登录号为SRX268395和SRX268398–SRX268402。使用BLAST针对GenBank核苷酸数据库搜索出现在大约3%或更高频率丰度的序列，并登记最接近匹配的样本位点。使用BioEdit 7.1.3.0(Tom Hall,Ibis Biosciences,Carlsbad,CA,92008)比对这些序列，并分析样品之间序列的同一性。


生物信息学和统计分析


使用微生物种群结构的可视化和分析(VAMPS)网站(评估了454个数据www.vamps.ml.edu)。数据图形设计和统计分析在Statistica 10(Statsoft,Tulsa,OK,USA)中进行。

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