研究简介:研究了淹水稻田土壤中好氧-缺氧界面处甲烷氧化细菌（MOB）的分布和活性。甲烷是重要的温室气体，而MOB通过消耗甲烷减少其排放到大气中。研究者利用微宇宙和冷冻切片技术，对土壤顶部3毫米进行了100微米级别的采样，并使用pmoA基因作为功能和系统发育标记，通过t-RFLP、微阵列和克隆测序等方法分析了MOB群落结构和活性。研究发现，在好氧-缺氧界面附近，甲烷氧化活性最高，89%的总呼吸作用被限制在一个0.67毫米厚的区域内。与Methylobacter相关的OTU在这一区域非常活跃，每个细胞中pmoA转录本高达18个，表明它适应了微摩尔范围内的氧和甲烷浓度。此外，与Methylosarcina相关的OTU与表层区域相关联，该区域高氧但甲烷浓度仅为纳摩尔级，表明这个OTU适应了贫营养条件。研究结果表明，不同的MOB OTU可以共享相同的微环境，并利用不同的生态位，这对于理解和管理甲烷排放具有重要意义。


Unisense微电极系统的应用


unisense氧气微电极（型号OX50）被用来确定微环境中垂直氧气分布情况。通过使用氧气微电极，研究者能够在微宇宙中精确测量氧气浓度的垂直梯度，从而确定好氧-缺氧界面的精确位置。通过测量氧气浓度的垂直分布，计算出土壤中氧气的消耗率，从而能够理解甲烷氧化过程对总呼吸作用的贡献。


实验结果


揭多样的甲烷氧化菌群落中的有限子集是活跃的，而且大多数活动被限制在0.67毫米厚的区域。然而，我们的实验显示了单一群落中不同OTU如何共享相同的微环境，从而利用不同的生态位。我们假设活性在MOB根据底物可用性分隔的氧-厌氧界面处最高。这确实是事实，Methylobacter相关的OTU和总体甲烷氧化的主导位于氧-厌氧界面。这个OTU似乎很适应于氧-厌氧界面，在那里氧气和可能是甲烷的浓度都在微摩尔范围内。这个OTU在表层，其氧气浓度高而甲烷浓度只有纳摩尔范围时是不活跃的。相反，Methylosarcina相关的OTU的转录本与表层层次相关，这表明其适应寡营养条件。

图1、氧气浓度和来源于pmoA基因及其转录本的垂直剖面。(a)用微电极测得的平均氧剖面。从图中可以看出，氧浓度近似线性下降到深度约1.3毫米，然后在约1.8毫米深度之前，浓度呈明显的弯曲达到零。(b)DNA和(c)RNA的pmoA tRF的相对丰度。tRF的系统发育从属关系以及其大小用括号标明。rRNA：来自非特异性逆转录和扩增16S和23S rRNA序列的不同tRF的相对丰度的合并值；RPCs：稻田簇的相对丰度。

图2、四个microcosms中基于DNA的群体结构的垂直分化。II型和Ia型MOB的平均相对丰度。II型对应于tRF 244；Ia型是所有其他片段的总和。与RT-PCR不同，DNA基础的分析没有遭受rRNA基因的非特异性扩增。

图3、Methylobacter相关片段（tRF 508）的竞争性t-RFLP分析。显示了pmoA基因拷贝数和pmoA RNA/DNA比率，带有Sawitzky–Golay平滑器（n=5）。根据图1a中显示的微剖面使用Berg的程序PROFILE ver.1.0（Berg等人，1998年）计算了氧气消耗速率，考虑了顶部2毫米。

图4、转录模式的非度量多维标度（NMDS；Bray-Curtis相异性；应力¼0.0689；R2=0.997；线性拟合，R2=0.989）通过pmoA微阵列杂交获得的平均值；来自四个微环境。图层显示为黑色符号。绿色、红色和蓝色外壳分别显示了三个不同的区域（表面，0–0.8 mm；缺氧-缺氧界面，0.8–2 mm和缺氧，2–3 mm）。区域之间的差异非常显著（相似性分析，Bray-Curtis相异性，Po0.001）。红色符号标记不同的探针。探针O_Mmb562对甲基藻具有特异性，将表面区域与其他两个区域分开的。


结论与展望


好氧甲烷氧化细菌（MOB）使用有限的底物范围，然而在一个稻田土壤中发现了430个物种等效的操作分类单元（OTUs）。这些OTUs如何在物理上共享它们的微生境尚不清楚。研究人员高度解析了MOB及其活性的垂直分布。使用microcosms和冷冻切片，在近原位条件下，在水饱和土壤的顶部3毫米中以100微米的步长进行了子采样。使用颗粒态甲烷单加氧酶基因pmoA作为功能和系统发育标记，通过末端限制片段长度多态性（t-RFLP），pmoA特异性的诊断微阵列以及克隆和测序来评估群落结构和活性。通过竞争性逆转录PCR结合t-RFLP来定量pmoA基因和转录本。


只有甲烷氧化引起的可能令人满意的总呼吸的89％限于氧-缺氧界面上方0.67毫米的厚度，这个界面可能由于甲烷氧化而引起。在这个区域，与甲烷浓度和氧气浓度在微摩尔范围内相关的一个与甲烷杆菌相关的OTU表现出极高的活性，每个细胞可达18个pmoA转录本，并且似乎适应于氧气和甲烷浓度。使用pmoA特异的微阵列分析转录本发现与表面区相关的一个与甲烷球菌相关的OTU。表面的高氧气体但只有纳摩尔的甲烷浓度表明该OTU适应于寡营养条件。没有发现II型甲烷氧化细菌（Methylosinus，Methylocystis）的转录本，这表明该组仅由休眠阶段代表。因此，在单一行业内的不同OTUs共享相同的微环境并利用不同的生态位。Unisense的氧气微电极技术为这项研究提供了一个强大的工具，使得研究者能够在微观尺度上精确测量氧气浓度，这对于揭示甲烷氧化细菌在淹水稻田土壤中的生态位分配和活性具有重要意义。