一氧化二氮(N2O)是一种重要的臭氧消耗物质和强大的温室气体，其效力大约是CO 2的265倍。在过去的三十年中，大气N2O浓度以每年0.73 ppb的速度逐渐增加。尽管N2O排放主要来自农业活动，但应密切监测污水处理厂的贡献N2O是在污水处理厂的生物脱氮过程中产生的，例如来自氨氧化、硝化器反硝化和不完全异养反硝化。外部添加的作为电子供体的碳源，例如乙醇、甲醇和醋酸盐，控制着在反硝化生物反应器中的反硝化性能和N2O排放量。尽管实际实施了异养反硝化细菌的外部碳供应，但尚未系统地研究它们的N2O消耗动力学和不同碳源的性能。因此，有必要进一步探索各种碳源对作为反硝化最后一步的N2O消耗的生物动力学的影响。本研究调查了不同有机碳源对经典反硝化进化枝I和进化枝II型N2O还原细菌N2O消耗生物动力学的影响。鉴于有机碳源的可用性是主要决定N2O消耗潜力的因素之一。


研究人员假设有机电子供体可能是控制(1)N2O相关生物动力学和(2)N2O消耗活动的弹性的因素之一在不同的N2O还原剂中以不同的方式暴露于氧气中，这取决于它们包含的能量代谢相关基因组。为了验证这些假设，研究人员使用微呼吸系统对N2O进行了在线监测，在有氧间隔和无氧间隔的缺氧条件下培养的微生物培养物中的N2O和溶解氧(DO)浓度。


建立了用于同时监测氧气和N 2 O的微呼吸测量系统，以检查不同有机碳源对N2O还原菌生物动力学的影响。细胞培养物在可容纳两个微电极和搅拌棒（Unisense）的H型瓶（有效体积为10 mL）中孵育。每种细菌进行五批测试，每批测试都有不同的碳源，即乙酸盐、琥珀酸盐、甘油、甲醇或乙醇。在每批试验开始时，将10 mL细胞悬液移入的H形微呼吸小瓶，微呼吸瓶中装有氧气和N2O微呼吸电极（Unisense，Aarhus，Denmark），在小瓶中没有顶部空间。随后，将20μL的浓缩N 2 O溶液（25°C下为24 mM）注入小瓶中，以达到大约50μmol L-1的初始N2O浓度。如下添加碳源和电子源：乙酸盐（320μmol L-1）、甲醇（420μmol L-1）、乙醇（210μmol L-1）、甘油（180μmol L-1）或琥珀酸酯（180μmol L-1)。过量添加有机化合物以确保N2O还原活性不受电子供体短缺的限制。微呼吸系统在保持在30±0.2°C的水浴中运行，以便与之前在相同温度下进行的结果进行比较，并以500 rpm的速度搅拌。使用Sensor Trace Suite软件(Unisense)处理N2O和氧气测量值。DO浓度与N 2 O浓度一起监测，因为它是影响N 2 O消耗活动的关键因素。


实验结果


本研究系统地比较了四种N2O还原菌在5种不同碳源下的N2O消耗和N2O回收情况。当N2O作为唯一的电子受体时，有机碳源显著影响了异养型N2O还原菌的生产性能、生物动力学和生物量产量。在碳源中，乙酸和琥珀酸对DO和N2O的消耗率最高，且进化支II型Azospira spI13的消耗率高于进化支I型Ps.stuzeri和Pa.denitrificans。由好氧向缺氧过渡后的N2OR恢复力主要依赖于N2O还原菌的类型和补充的碳源。当添加乙酸和琥珀酸时，II型nosZ菌的生物量比I型nosZ菌高。

图1、微呼吸系统示意图，建立了用于同时监测DO和N 2 O的微呼吸测量系统，以检查不同有机碳源对N 2 O还原菌生物动力学的影响。

图2、反硝化细菌（进化枝I）、施式假单胞菌（进化枝I）、固氮罗菌株I09（进化枝II）和固氮罗菌株I13（进化枝II）中N 2 O（红色）和氧气（蓝色）浓度分布的动态变化。使用乙酸盐(a)、琥珀酸盐(b)、甘油(c)、乙醇(d)和甲醇(e)作为碳源。体系中N2O注射用黑色垂直箭头表示。图中显示了代表性的N 2 O和DO浓度分布。

图3、以乙酸、琥珀酸、甘油、乙醇和甲醇为碳源对应的反硝化细菌(clade I)、施式假单胞菌（cladeⅡ）/固氮罗菌属I09（cladeⅡ）、固氮罗菌属I13（cladeⅡ）的氧气消耗率的全细胞Michaelis-Menten曲线。这些数据是从三次试验中获得的。

图4、以乙酸、琥珀酸、甘油、乙醇和甲醇为碳源对应的反硝化细菌(clade I)、施式假单胞菌（cladeⅡ）/固氮罗菌属I09（cladeⅡ）、固氮罗菌属I13（cladeⅡ）的氧化亚氮的消耗率的全细胞Michaelis-Menten曲线。这些数据是从三次试验中获得的。

图5、缺氧条件下N2O还原活性的恢复。横轴表示DO耗尽后的时间。数据点来自三次N2O呼吸试验。实线表示各碳源N2O还原恢复的线性模型，虚线表示95%置信区间。


结论与展望


利用一氧化二氮(N2O)还原细菌是减少工程系统的N2O足迹的一种很有前景的策略。使用优选的有机碳源作为电子供体可加速这些细菌对N2O的消耗。然而当喂食不同的有机碳物种时，它们的N2O消耗潜力和活性仍不清楚。本论文研究人员通过研究它们的生物动力学特性和基因组潜力，系统地比较了各种有机碳源对N2O还原细菌活性的影响。五种有机碳源——乙酸盐、琥珀酸盐、甘油、乙醇和甲醇被送入四个含有进化枝I或进化枝II nosZ基因的N2O还原细菌。


使用Unisense微呼吸系统对四种N2O还原细菌菌株进行了呼吸测定分析，确定了响应于不同喂养方案的溶氧和N2O消耗生物动力学的不同变化。不管N2O还原菌是什么，使用乙酸盐和琥珀酸盐都获得了更高的N2O消耗率和更高的生物质产量。通过基因组分析研究了代谢补充碳源的潜力，其结果证实了N2O消耗生物动力学结果。此外，电子供体的选择对N 2O消耗活动在氧气暴露后恢复。本研究的结果有助于为污水处理厂异养反硝化过程中产生和排放的N 2 O制定有效的缓解策略。