本文提出了一种多管离子选择性微电极对作物中硝酸根和铵根离子同时进行检测的方法，并在典型设施栽培作物番茄的含氮量检测中进行了验证，实现了番茄含氮量的实时、快速、准确和非破坏活体测量。


1、材料与方法


1.1仪器和测试方法


微电极信号放大器使用MultiClamp 700B膜片钳放大器(AXON公司美国)，工作于I=0模式；数据记录采用pCLAMP10软件；微电极夹持和定位采用MP-285微操纵器(SUTTER公司，美国)。


参比电极选用Ag/AgCl电极。硝酸根离子浓度测量电池为：(-)Ag|AgCl(s)|50mM KCl和50mM KNO3的混合溶液|硝酸根离子敏感膜‖待测溶液‖Ag+|Ag(+)。


铵根离子浓度测量电池为：(-)Ag|AgCl(s)|50mM KCl溶液|铵根离子敏感膜‖待测溶液‖Ag+|Ag(+)。所有测量都在室温(20～25℃)下的法拉第屏蔽网内进行。


1.2多管离子选择性微电极的制备


多管离子选择性微电极的制备包括敏感剂的配制、电极拉制、硅烷化，以及敏感剂、电极内充液的充灌等。


本文设计的多管离子选择性微电极由粘结在一起的3根轴向平行的微玻璃管组成。微玻璃管经拉制后，在其尖端分别灌充硝酸根、铵根离子敏感剂，然后分别灌入硝酸根离子、铵根离子、参比的内充液，每种内充液中分别插入1根信号线引出信号，用密封胶在微玻璃管的尾部进行密封，如图1所示。

1.硝酸根离子敏感剂2.铵根离子敏感剂3.多管微玻璃管


1.2.1敏感剂的筛选


对国内外市场上已有的硝酸根离子、铵根离子敏感剂或离子敏感剂配方进行筛选，根据离子选择性、斜率、响应时间、重现性及稳定性等指标确定最适宜的离子选择性敏感膜。


从已公开发表的文献中选择了5种硝酸根离子敏感剂配方和6种铵根离子敏感剂配方，分别用A1-A5和B1-B5表示。其中，配方A1为Nitrate ionophore I-cocktail A(Sigma-Aldrich，美国)；配方B1为Ammonium ionophore I-cocktail A(Sigma-Aldrich，美国)。配方A2-A5组成如表1所示，配方B2-B6组成如表2所示。


1.2.2电极拉制


采用PMP107型可编程多管拉制仪(PMP-107，美国)的标准3管拉制程序，将1根3管玻璃管(Hilgenberg，德国)拉制成两根尖端直径为微米级的多管微电极。

表1硝酸根敏感剂配方

表2铵根根敏感剂配方


1.2.3微电极硅烷化


将拉制好的多管微电极置于精密鼓风干燥箱(BPG-9040A，中国)中，150℃下烘烤1h，除去残存在微电极内的水蒸气和杂质；将多管微电极放置在带盖的玻璃器皿中，放入3mL 5%的二甲基二氯硅烷(国药集团，上海)，使多管微电极浸泡30min，然后在150℃下继续烘烤，使二甲基二氯硅烷的蒸气进入和充分附在微电极的尖端，形成一层疏水层，以利于硝酸根和铵根离子敏感膜的形成和作用。硅烷化后，将去盖的玻璃器皿在150℃下烘烤，使过量的二甲基二氯硅烷蒸发掉。


1.2.4微电极的充灌


使用微量进样针将硝酸根离子敏感剂、铵根离子敏感剂从电极尾端缓慢推入微电极尖端;在显微镜下观察微电极内是否有气泡,若存在气泡，须将微电极尖端朝下放置一段时间，直至气泡完全从微电极中消失;然后在微电极管内分别充入相应的硝酸根离子内充液及铵根离子内充液。


1.3电极的标定


标准曲线法是离子选择性微电极最常用的一种分析方法。将充灌好的多离子选择性微电极分别放在配制的0.1M、0.01M、1.0mM、0.1mM、0.001mM的硝酸根离子和铵根离子标准溶液中，分别测定其电位，用以评价电极的响应范围、检测下限及斜率等性能指标。


2、结果与分析


2.1多管离子选择性微电极的响应参数


测定了用不同离子敏感剂或离子敏感剂配方制成的离子选择性微电极，硝酸根离子选择性微电极在一系列硝酸根离子浓度为0.1M～0.001mM的标定溶液的标定曲线，如图2所示；响应参数如表3所示。铵根离子选择性微电极在一系列铵根离子浓度为0.1M～0.001mM的标定溶液的标定曲线，如图3所示；响应参数如表4所示。


从表3中对比可得，配方A1制成的敏感膜性能优于其它配方。因此，选取配方A1作为本研究的硝酸根离子敏感剂。


配方编号响应范围/M斜率/mV·(log[NH4+])-1检测下限/M响应时间/sB110-1～10-558.62010-58B210-1～10-451.39310-415B310-1～10-439.94710-450B410-1～10-433.50710-460B510-1～10-428.62310-475


从表4中对比可得，配方B1制成的敏感膜性能优于其它配方。因此，选取配方B1作为本研究的铵根离子敏感剂。


2.2多管离子选择性微电极的离子选择性


采用混合溶液法测定了多管离子选择性微电极的选择性，如表5所示。表5中所有的阴离子均采用钠盐，所有的阳离子均采用氯化物。


从表5中可以发现:Br-对NO3-选择性微电极有一定干扰，但番茄作物中Br-含量较少，其影响可以忽略不计;K+对NH4+选择性微电极有轻微干扰。

表5多管离子选择性微电极的选择性


2.3多管离子选择性微电极的稳定性


研制的多管离子选择性微电极，在室温下(温度波动在±2℃内)连续测量10h，当NO3-浓度为10-2M时候，电极电位波动在±1.5mV，相对误差为1.3%。


2.4多管离子选择性微电极的重现性


在室温下(温度波动±1℃)使用同一支多管离子选择性微电极对硝酸根、铵根离子浓度均为1mM的被测溶液进行重复测量，每天测试3次，每次连续测量4h，测试结果如表6所示。

表6微电极的重现性


表6中的标准偏差值较小，说明研制的多管离子选择性微电极重现性较好。


2.5番茄氮素营养检测


采用所研制的多管离子选择性微电极对其设施栽培番茄叶片样本中NO3-及NH4+浓度进行测试，测得的NO3-和NH4+的离子敏感电极信号稳定后，其电压值分别为-103.84 mV和-16.53mV，如图4所示。根据NO3-和NH4+选择性微电极的标定曲线，计算出番茄叶片内NO3-和NH4+的浓度分别为0.20mmol/L和0.51mmol/L，转换成总氮质量比浓度，得番茄叶片中含氮量为25.00mg/g。

图4多管离子选择性微电极信号记录图


对番茄叶片样本的总氮量进行检测，由AA3连续流动分析仪(SEAL，德国)测得番茄叶片样本中含氮量为26.03mg/g。


与采用AA3连续流动分析仪测得的含氮量相比，采用多管离子选择性微电极测得的番茄叶片中含氮量绝对误差为1.03mg/g,相对误差为3.96%。


结论：筛选出的硝酸根离子选择性微电极和铵根离子选择性微电极组成的多管离子选择性微电极，有良好的离子选择性、重现性和稳定性。与采用AA3连续流动分析仪测量番茄叶片的含氮量相比，采用该方法测量的绝对误差为1.03mg/g,相对误差为3.96%。因此，采用该方法制作的多管离子选择性微电极检测番茄叶片中的含氮量是可行的。