阿尔茨海默病(AD)和缺血是最常见的两种脑疾病，两者存在潜在的联系。研究发现，一方面，脑缺血的病人后续患AD的可能性被大大增强;另一方面，先前患有AD的患者，脑缺血的发生会进一步加剧认知能力的下降。但是两种疾病间的病理分子机制的区别和联系尚不清楚，因此发展对缺血和AD关联性分子的研究，对于探索两者疾病之间的联系，疾病的早期诊断和治疗均具有十分重要的研究意义。然而由于脑部微环境复杂、体内外环境差异大以及体内分子之间相互关联等原因，所以建立高选择性、高准确度和多物质同时检测的分析方法仍是一项巨大的挑战!本课题主要围绕缺血和AD密切相关的氯离子及活性硫活体检测中的选择性、准确度等关键科学问题，设计和构建了系列活体分析新方法，并建立活体分析新方法，成功实现了缺血和AD鼠脑中氯离子和活性硫的活体分析，为其在缺血及AD疾病模型下鼠脑中的分子机制的研究提供了有效的方法。


主要研究内容如下:


(1)基于AgNPs可电化学氧化生成Ag~+，并进一步与Cl~-反应生成AgCl的EC反应原理，我们以AgNPs的氧化电位作为Cl~-的测定信号，亚甲基蓝(MB)作为内参比信号，成功制备了一种无标记的可实时校准的电化学传感，并用于脑缺血和AD鼠脑模型中Cl~-的实时监测。结果表明该传感器对Cl~-呈现具有良好的选择性，不受生物体常见的干扰物的影响，特别是卤素阴离子的干扰，对Cl~-在1~300 mM浓度范围内具有良好的能斯特响应，响应灵敏度为58.3 mV/pCl~-。此外，以MB作为电位矫正的内参比，可以有效消除测定环境的差异引起的实验误差，显著提高对Cl~-检测的准确度、重现性与稳定性。最后，结合微电极技术，我们成功将该传感器应用于AD和缺血两种脑疾病模型鼠脑中三个脑区(海马、纹状体、皮层)中的Cl~-测定。结果发现:AD鼠脑海马区Cl~-水平比正常鼠脑偏低(正常组:100±5 mM(n=5);AD组:64±3 mM(n=5))，其他脑区基本不变。缺血30 min后，纹状体和海马中的Cl~-浓度分别下降了19.8±0.5%(n=5)和27.2±0.3%(n=5)，然而皮层中Cl~-浓度并没有明显变化。这些结果为探索Cl~-在脑疾病中的作用提供了有用的数据，也为活体分析中其他离子的检测方法的建立提供了更准确的分析模式。


(2)设计并构建了一种Turn-on型电化学生物传感器用于同时监测小鼠脑中的内源性H_2S_n和H_2S。首先，借助DFT计算，我们合理设计并合成了对H_2S_n具有特异性响应的新型电化学探针分子M_(PS-1)和M_(PS-2)，以及特异性识别H_2S的探针分子M_(HS-1)和M_(HS-2)。鉴于良好的可逆性及电化学信号无交叉干扰的特性，M_(PS-1)和M_(HS-2)被最终选定作为H_2S_n和H_2S的探针分子，并共组装在具有抗污染特性的介孔金修饰的碳纤维电极表面，构筑了可同时检测H_2S_n和H_2S的电化学传感。实验结果表明:该传感器对H_2S_2和H_2S均具有良好的响应，分别在0.2-50μM、0.2-40μM范围内呈现良好的线性关系，且同时检测无交叉干扰。此外，该传感器具有选择性高、响应时间快和抗污染能力高等优点。最后，基于该传感，我们成功将其用于活体小鼠脑皮质、海马和纹状体中以及脑切片中H_2S_n和H_2S的活体检测。结果发现:在鼠脑缺血2 h后及AD模型鼠脑中，H_2S_n的水平均出现升高，而H_2S的水平下降。通过Western-Blot实验发现:在缺血和AD小鼠脑模型中，TRPA1蛋白的表达与H_2S_n水平变化具有正相关性。进一步的脑切片实验表明，在相同量H_2S_n和H_2S的刺激下，H_2S_n激活TRPA1蛋白表达是H_2S的4.4倍。这项研究不仅首次实现了在两种鼠脑模型中H_2S_n水平的变化分析，而且为深入阐明H_2S_n和H_2S在脑疾病中发挥的作用提供了新的见解。


(3)基于表面增强拉曼技术和PCA技术相结合，我们构建了一种具有高准确度和高灵敏度的单分子比率型拉曼探针(AuNRs/DEP)，并成功实现对AD鼠脑模型透析液中多种活性硫的检测。首先，我们合成了具有表面增强拉曼散射功能的金纳米棒(AuNRs)。其次，合理设计并合成了多响应探针分子，2-(3，5-二硝基苯氧基)-4-(2-(4-乙炔基苯甲酰氨基)乙基)苯基2-氟-5-硝基苯甲酸酯(DEP)。该分子设计主要由内参比基团和响应基团组成，扮有多重识别功能:第一部分为内参比乙炔基团，其可与AuNRs通过共价键键合，将识别分子DEP一步组装于纳米基底表面;与此同时，炔基位于生物体内拉曼静默区，可以作为内参比构建比率型探针，提高测定的准确度。第二部分响应基团分别由醚键、酯基和C-F键组成，分别作为H_2S，H_2S_n，以及H_2S_n和Cys的识别位点。


接着，将DEP分子与AuNRs通过金炔键连接，一步制备了AuNRs/DEP的多功能拉曼探针。该探针对不同活性硫物质在不同波长处显示不同的SERS响应。通过PCA分析可得，PC1与H_2S、H_2S_n和Cys各自的浓度对数都具有有良好的线性关系，并可实现三种物质的同时拉曼分析。结合探针良好的分析性能，最终该AuNRs/DEP拉曼探针成功用于AD鼠脑模型脑透析液中H_2S、H_2S_n和Cys的同时监测。