微电极制备、表面修饰及活体／单细胞电分析应用


赵旭 王克青 李博 李长青 林雨青 （首都师范大学化学系北京１０００４８）

摘要

微电极是指至少在一维尺度上不大于２５μｍ的电极。微电极由于尺寸小而具有一些常规电极无法比拟的性质，如具有电流密度高、响应速度快、欧姆压降（ｉＲ降）小、信噪比高等特点。微电极特殊的性质使其在电化学测试中具有独特的优点和重要性，并在分析化学、生物学及医学等方面得到了广泛应用，尤其在生命分析领域如在单细胞检测和活体分析中具有众多重要的应用。微电极的设计制备是微电极电化学发展应用的关键，目前涌现出的制备微电极的技术有电化学刻蚀法、电沉积法、自组装技术、化学镀层技术等，这些制备方法为快速制备微电极提供了可能性。本文综述了近年来微电极的研究进展，包括微电极的特点、分类、制备方法及其单细胞检测和活体分析方面的应用，最后提出了微电极面临的挑战与发展方向。


１引言

在电化学的研究中常见的电极尺寸是毫米级别，由于其尺寸比较大，限制了其在一些领域的应用。为了满足小空间中如活体、细胞的电化学分析应用需求，微电极应运而生。一般来说，微电极是指至少在一维尺度上不大于２５μｍ的电极［１］，其尺寸小于扩散层厚度。目前，微电极是电化学研究中兴起较晚，也正蓬勃发展的一个领域。微电极有利于实现检测装置的集成便携化，同时能够在介电常数较低的有机溶剂中检测电化学活性物质，近年来受到广泛的关注［２］。微电极具有常规电极无法比拟的性质，例如电流密度高［３］、响应快速、ｉＲ降小、信噪比高、传质速度快、易达到稳态等，这些优势使其在很多方面的快速、高灵敏检测成为可能。从１９６０年开始人们发现超微电极具有优良的电化学特性。在神经化学领域研究中，Ａｄａｍｓ和他的同事研究了一些生物胺类在微电极上的氧化过程及检测方法［４］。在此基础上，Ａｄａｍｓ［５］将碳糊电极植入到麻醉的鼠脑中，证明了传统的伏安技术能够成功应用到生物组织分析，同样证明神经递质能够从突触间隙的空间扩散到电极表面。与此同时，Ｗｉｇｈｔｍａｎ等［６］发现微电极在伏安技术方面具有比常规电极更为优越的某些特性，展示了微电极在电化学及电分析化学领域中具有良好的应用前景，从而引起了有关研究人员的广泛兴趣。目前，微电极的研究成为电化学的前沿领域，为研究者们探索物质的微观结构、电化学性质和电化学过程提供了一种强有力的手段，并在生命环境分析领域具有重要应用。制备微电极的方法多种多样，有电沉积法［７］、电化学刻蚀法［８］、激光拉制法和内部填充法等。近年来，随着科学技术的发展，在制备微电极方法上涌现出很多新的技术，如自组装技术［３］、化学气相沉积、模板法、离子束刻蚀技术［３］、丝网印刷术［９］、紫外光照射化学镀层技术［１０］等，这些制备方法为快速、高效制备微电极提供了新的思路。微电极在生命分析领域中的细胞检测、活体生物原位分析等方面具有广泛应用［１１～１４］。在微电极表面进行修饰之后可以用来实现高选择性和高灵敏检测细胞和活体中神经递质类物质的含量以及体内一些关键信号分子，如ＮＯ，ＣＯ等［１５］。微电极还可以应用在毛细管电泳⁃电化学检测系统［１６］，作为扫描离子电导显微镜和扫描电化学显微镜的探针［１７，１８］，研究电化学反应的动力学参数［１９，２０］，环境分析中检测水中重金属离子［２１］，检验食品新鲜程度［２２］和电位型活体细胞传感等方面［２３～２６］。总之，微电极可以广泛应用于活体分析、生物传感、生物细胞检测、扫描探针显微镜领域、毛细管电泳⁃电化学检测系统、生命科学、食品学和环境分析与监测等各个领域。

基于微电极的高灵敏、高时空分辨检测神经化学物质的分析方法有助于追踪神经系统中活性物质如能量代谢物质、神经递质及其代谢产物、ＮＯ等小分子动态释放，进而有助于理解中枢神经系统障碍或疾病产生的分子机制。根据微电极在生命分析领域中的重要意义，本文综述了近年来微电极的研究进展，包括微电极的特点、分类、制备方法以及在单细胞、活体等方面的最新应用研究。


２微电极的特点

由于微电极的电极尺寸达到微米级，因此具有常规电极无法比拟的电极特性。

２.１电流密度高在一定电压下，微电极能够产生电化学响应信号。半径很小的电极以非线性扩散中的径向扩散为主，由于电极尺寸小，所得扩散电流在短时间内即能达到稳态［２７］。研究结果表明当电流达到稳态时，电流的密度与电极半径成反比，因此，微电极具有很高的电流密度［７］。

２.２ｉＲ降小

在电解池中存在电极自身的电阻和电极表面附近溶液层的电阻，从而会产生ｉＲ降。而在微电极上产生的极化电流数量级一般在１０－９Ａ左右，甚至可达到１０－１２Ａ，因此ｉＲ降小。

２.３信噪比高

充电电流ｉｃ与时间ｔ的关系如下式表示：

ｉｃ＝ΔＥＲｅｘｐ（－ｔＲＣ）（１）

式中，ΔＥ为阶跃电位的幅度，Ｒ为电解池内阻，ｔ为阶跃电位持续时间，Ｃ为双电层电容［２８］。电极／溶液界面的电容Ｃ∝ｒ２０，而溶液的阻抗Ｒ∝１／ｒ０，因此，时间常数ＲＣ∝ｒ０。ｒ０减小使微电极的时间常数ＲＣ降低，充电电流ｉｃ的衰减速率变得更快，因而增加信噪比，可提高测定的灵敏度。相比之下，常规电极的尺寸大，导致信噪比降低，并不适合于快速的电化学反应研究［２９］。

２.４传质速度快且易达到稳态

超微圆盘电极的扩散传质速率Ｍ可以用式２［３０］表示：

Ｍ＝４Ｄ／（πｒ）（２）

Ｄ为扩散系数，ｒ为电极半径。ｒ越小，扩散速率越快。与此同时，当电极表面传质速率快时，反应物向电极表面传输的过程中不受干扰。因此，可使用微电极研究速率较快的电化学反应［２８］。基于上述微电极传质规律可得到微电极的稳态扩散电流，公式如下：

ｉ＝４πｎＦＤｃｏｘｒ０（３）

式中，电流为稳态电流，与氧化态物质在溶液中的浓度（ｃｏｘ），扩散系数（Ｄ），电极半径（ｒ０）有关［２８］。另外，微电极的循环伏安图呈现典型的Ｓ形，而不出现常规电极所形成的峰形。

２.５简化测量装置

在常规电极的伏安实验中，为了达到体系的稳定，常采用三电极体系进行测量。而在微电极的体系中，对电极比微电极的面积大１０４～１０５倍，对电极上电流密度极低、基本不发生极化，因此，参比电极可同时作为对电极来使用，即在微电极体系中采用二电极体系，从而简化实验装置。

２.６存在的不足

因为微电极尺寸小，所以制备难度大，成本较高，成功率和重现性也是一大难题。通过微电极的电流很小，电流大小达到ｎＡ甚至ｐＡ级别，所以检测系统应具有更高的信号检测灵敏度。另一方面，由于微电极体系电流信号小，受到环境干扰大，因此，对实验条件的要求比常规电极体系高。目前，加工技术越来越精细，电子技术也有所提高，针对以上这些问题，得到了较好的解决策略。


３微电极的类别与制备方法

按照不同的电极制作材料，伏安法或者安培法用的微电极主要分为非金属微电极和贵金属微电极两类。非金属微电极中多以碳超微电极、碳纤维微电极［５］和碳纳米管功能化微电极为主；在贵金属微电极中，铂微电极和金微电极［２９］最为广泛。最常用的电极材料中，碳纤维微电极电势窗口宽，多应用于水溶液体系的电分析。与贵金属微电极相比，碳纤维微电极双电层电容大、背景电流高，因而在检测中信噪比较低［３１，３２］。根据微电极的形状特点，微电极包含微盘电极、微圆盘电极和微环电极等［２９］。按照电极的尺寸大小，可将电极分为微电极（１００ｎｍ～２５μｍ）［１］、超微电极（１００ｎｍ～１μｍ）和纳米电极（＜１００ｎｍ）［３３］。

微电极具有诸多优异性能，越来越多的研究者对微电极产生了浓厚的兴趣。制备微电极的传统方法中多以电沉积法［７］和电化学刻蚀法［８］为主。电沉积法即为在基底上沉积电极材料或包覆层［７］。通过电沉积法制备微电极的几何形态主要呈现圆锥形、半球形、球形。最近，Ｚｈａｎｇ等［３４］基于电沉积法制备不同金属材料的电极，如金、铂、银和铜微电极，其电极尺寸小于１００ｎｍ，对比之前的制备方法，利用该制备方法可控制电极尺寸大小。电化学刻蚀法多以制备半球型微电极为主，如Ｐｅｎｎｅｒ小组［８］使用电化学刻蚀法制备尖端尺寸为１ｎｍ左右的电极。具体操作过程如下：首先，在一定的电位下将放置在溶液中的金属丝进行电化学刻蚀之后，可得到锥形的纳米尖端。尖端表面填涂电泳漆、熔融玻璃、环氧ＡＢ胶等绝缘物质之后，即可制备出半球型微电极。电化学刻蚀法成本低、仪器简单、重现性好，经过多次绝缘之后方可得到尺寸更小的微电极，因此制备过程较为繁琐。目前，还有一些制备微电极的技术，如自组装技术、离子束刻蚀技术［３］、丝网印刷术［９］、化学镀层技术［１０］等，这些都是快速制备微电极的方法。

３.１碳超微电极

在非金属微电极中，碳超微电极由于其尺寸易于调控，应用广泛，因而引起有关研究人员的广泛兴趣。Ｕｎｗｉｎ课题组［１８］将石英毛细管拉制呈尖锐的纳米尖端，外壁热解丁烷沉积碳形成柱状电极，其电极尺寸易于调控。该方法简单、快速，得到的电极尺寸相对较小且灵敏度高，可应用于扫描电化学显微镜的探针。随后，该课题组［３５］制备了一种半径在５～２００ｎｍ的圆盘状碳纳米电极。将石英毛细管拉制呈尖锐的纳米尖端，使用从上至下的方法制备碳纳米电极，在其尖端高温热解后沉积碳，制成内径在５～２００ｎｍ的碳超微圆盘电极，这种电极由于尺寸易于调控，可用于单细胞检测。在此电极上沉积铂后可用来监控脑片外部和内部中的耗氧量。另外，这些纳米电极可以作为扫描离子电导显微镜的探针［１７］，使得活细胞中的成像具有很高的分辨率。

本课题组［３６］通过将中空的多根石英毛细管缠绕拉制形成微电极阵列支撑体，然后通过热裂解乙炔将碳沉积于石英管内壁形成碳的微环状电极，构筑了尖端为１０～５０μｍ、数目可达１５个微电极的阵列，应用一个含有８个微电极的微电极阵列可进行单个嗜铬细胞瘤细胞胞吐过程中不同位点释放的电化学成像研究，初步检测到亚细胞层次的胞吐空间分布不均匀性。这一方法为单个可寻址微电极阵列的制备提供了一个全新的思路，为高通量活体分析奠定了坚实的平台基础。

３.２碳纳米管微电极

碳纳米管微电极具有高机械强度、高长径比、良好的导电性等特点使得碳纳米管已经广泛应用到不同的电化学检测中［３７，３８］。研究表明［３９］，碳纳米管修饰碳纤维微电极用于神经递质检测时，该电极上电子转移的动力学得到提高并且对有吸附作用的物质的灵敏度有所提高（如多巴胺），而且电极不易受普通生物物质的影响，例如５⁃羟吲哚乙酸。此外，将碳纳米管固定在碳纤维微电极上，并将此电极浸泡在碳纳米管⁃全氟磺酸的悬浮液中首次制备出了碳纳米管微电极［３９］。不过，此方法重现性较低。进一步的工作证明单壁碳纳米管化学自组装是在碳纤维圆盘电极上形成均匀排列的碳纳米管层的一种有效方法［４０］。体内和体外的实验证明碳纳米管修饰的电极检测多巴胺时灵敏度可提高３６倍。

３.３碳纤维微电极

碳纤维微电极的传统制备方法是将碳纤维插入到绝缘性能良好的玻璃或者石英毛细管内，高温拉制成两个具有尖端的电极，利用环氧液滴对尖端进行密封，并暴露出尖端碳纤维，对尾端碳纤维用导线连通，即可成功制备。该微电极直径（１００～６００μｍ）较小。因此，它在植入过程中对组织损伤很小，使其得到广泛的应用［５］。Ｔｉａｎ课题组［３２］第一次在碳纤维微电极上电沉积金纳米粒子进而检测超氧根离子，该检测方法具有一定的选择性、灵敏性和稳定性。另外，由于碳纤维微电极的生物相容性好有利于增强活体中超氧根离子的响应信号。Ｍａｏ课题组［４１］制备碳纤维微电极在活体中选择性检测氧气，在碳纤维表面高温热解酞菁铁然后电沉积上铂纳米粒子，此电极展现出快速的动力学过程，氧气通过四电子转移过程发生还原反应而不形成过氧化氢。这项研究提供一种新颖、可靠的制备方法，用于高灵敏、高选择性地监控在不同生理过程中体内的氧气含量，微电极可用于活体测定氧气含量。

３.４铂微电极

在贵金属微电极中，常使用到的是铂微电极或者金微电极。Ｂａｒｄ小组［４２］已经运用电沉积法制备Ｈｇ／Ｐｔ半球电极。Ｃｈｅｎ等［４３］通过电沉积方式使得金纳米粒子整齐地包被在铂盘表面，进而制备出铂微电极，从而实现纹状体中多巴胺含量的检测，响应时间短（＜２ｓ），灵敏度提高了２.６倍。Ｚｈａｎｇ等［４４］将直径为２５μｍ的铂线通过拉制、密封、刻蚀等操作成功制备了铂微圆盘电极。另外，该课题组［４５］还在较低的阳极电位下，快速地制备出覆盖有薄层氧化铂的微电极。Ｕｍｅｄａ等［４６］将直径为５０μｍ的铂线进行高温热封、抛光和覆盖一层全氟磺酸膜操作之后，制备出铂微圆盘电极用于检测氧还原反应（ＯＲＲ）中产生的过氧化氢总量。Ｌｅｅ课题组［１５］将铂线热封在已经拉制好的玻璃毛细管里，在氯化钙溶液里进行刻蚀操作，之后电沉积上铂黑形成铂微圆盘电极用于检测一氧化氮含量。因此，将铂丝进行拉制、密封、刻蚀、修饰等操作之后，铂微电极即可制备而成。

３.５金微电极

金微电极的制备主要是通过在绝缘条件下埋藏一根金导线，并用绝缘材料密封。随后通过电化学的刻蚀［４７］、抛光［４８］、激光拉制［４９］的方法制备成微米大小的微电极。Ｍｉｒｋｉｎ课题组［４９］通过激光拉制器减小电极尺寸，他们制备的金微电极直径为４０ｎｍ。到目前为止，涌现出许多制备金微电极的方法，主要包括电沉积法、自组装技术和化学镀层技术。

ＤｉＬｏｒｅｎｚｏ［５０］报道了一种快速、简单、高效的电沉积方法制备金微电极，即在０.１ＭＨＡｕＣｌ４和１ＭＮＨ４Ｃｌ溶液中使用简单的电沉积方法，将该电极用于葡萄糖的检测。Ｂａｒｄ等［２０］报道了基于金纳米颗粒的自组装功能（金纳米颗粒通过二硫键实现自组装），通过自组装技术成功制备金球形电极。其制备过程简单，首先向拉制好的毛细管尖端空腔内注入１，９－壬二硫醇，然后把尖端浸入金纳米颗粒溶胶中，最后调节毛细管尖端大小，即可得到直径为１～３０μｍ的球形电极。该方法反应温和且成本低廉。

本课题组［１２］采用无毒聚多巴胺多功能材料代替常用的（３⁃氨基丙基）⁃三乙氧基硅烷，发展了一种新颖、简便、快速的化学镀层技术自下而上制备金环微电极的方法。如图１所示，此金环微电极制备过程为在毛细管内壁羟基化，毛细管内壁自组装上聚多巴胺层，盐酸羟胺还原氯金酸形成金纳米粒子，促使金纳米粒子生长并形成金膜。最终制备而得的金环微电极顶端最小直径达到１０μｍ，可控制的金膜厚度达到２００ｎｍ～３μｍ。通过金纳米粒子与巯基的自组装可实现对活体中多巴胺的检测。

Ｈｅ等［１０］提出一种制备金微电极的化学镀层方法，主要是通过紫外照射的方法使得在聚苯乙烯板上沉积金纳米粒子从而形成金微电极。如图２所示，从低压力汞灯发射的高能量的紫外光照在聚苯乙烯的表面上，使得在照射条件下产生光化学催化的羧基官能团进而与金纳米粒子结合，最终通过化学镀层技术形成金膜。通过在聚苯乙烯上形成金微膜，能够准确控制电极尺寸，制造成本低廉。该电极具有良好的稳定性和优良的电化学性能，他们将此电极应用于多巴胺和儿茶酚胺含量的检测和分离。

在多样化微电极发展的基础上，微电极阵列由于具有高时空分辨率，可以在同一时间从微小的空间如组织和细胞上记录到更多的化学物质代谢变化过程，也引起研究者广泛关注［４］。通过单独控制每个电极的电位可以同时检测到不同的分析物，或者可以记录到单个细胞表面不同空间位点同一化学物质的释放。

图１金环微电极的制作步骤［１２］。（Ａ）拉制好的空玻璃毛细管；（Ｂ）毛细管内壁羟基化；（Ｃ）毛细管内壁自组装上聚多巴胺层；（Ｄ）内壁生长金纳米粒子；（Ｅ）形成金膜；（Ｆ）金环微电极尖端修饰３⁃巯基丙酸

图２在聚苯乙烯薄片上制备电极的步骤图解［１０］。（ａ）紫外照射；（ｂ）氨基；（ｃ）金纳米粒子；（ｄ）金层

捕捉亚细胞水平的细胞胞吐的变化时，微电极阵列测量尺寸和电极间距必须小于细胞（一个神经元直径约为４～１２０μｍ）直径大小。通过将碳纤维插入到多管玻璃中制备出碳圆盘微电极阵列和在石英毛细管内热解乙炔沉积碳，可分别形成７和１５个碳环微电极阵列［３６，５１］，用于检测单细胞释放的物质。研究人员还利用各种微制作的方法来制备可增加电极数量的微电极阵列。此类微电极阵列可应用在单细胞和细胞网络中［５２，５３］。Ｗａｎｇ课题组［５２］报道了一种制备单个可寻址微电极阵列的方法，可用来检测单个嗜铬细胞瘤细胞释放的神经递质物质。他们发展了一种在铂微电极阵列上修饰IV型胶原的方法，可以促进细胞黏附和生长。他们设计的新装置包含３６个微电极，微孔大小为４０μｍ×４０μｍ，此装置可直接将体外培养的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞定位在传感器的正上方。ＭｃＣａｒｔｙ等［５４］在三个凹槽里通过裂解、光刻等技术制备微电极阵列，制备方法重现性好，稳定性良好，该课题组将微电极阵列简单地移植到体内中可实时记录纹状体中多巴胺的释放信号。该课题组［５５］还报道了碳超微电极阵列的制备方法。装置包括４～１６个通过热解光致抗蚀剂制备而来的微电极，此装置易受光刻控制，并且已经在性能方面类似于玻碳电极。Ｃａｉ课题组［５６］构筑了一种高灵敏的微电极阵列，并在微电极阵列上电沉积聚吡咯石墨烯，用于检测嗜铬细胞瘤细胞释放的多巴胺含量。该检测方法具有高灵敏性、特异性良好、检出限低和响应快速等特点。


４微电极的活体／单细胞应用

由于微电极尺寸小、响应时间短、表面传质速率快、对细胞或组织损伤小，可将微电极应用于生命科学领域，进行单细胞分析，测定生物体内活性物质，进而用来高灵敏、高时空分辨监测一些参与生理过程的小分子物质在神经系统中的动态释放，以此研究中枢神经系统疾病发生前后的物质变化，为生理学和病理学研究提供指导。由此可以看出，使用微电极可实现对生物组织的实时、在线分析。本节详细介绍微电极检测神经化学活性物质（多巴胺、抗坏血酸、儿茶酚胺）以及小分子（过氧化氢、一氧化氮）。

４.１活体检测

碳纳米管修饰的碳纤维微电极应用于活体分析检测中。Ｚｈａｎｇ等［１１］用一种新的电化学方法应用于活体脑中的抗坏血酸的检测，如图３所示。基于碳纳米管的电化学性质有利于抗坏血酸进行氧化反应，可利用多层次的碳纳米管修饰碳纤维微电极检测抗坏血酸含量，相对于鼠脑中共同存在的其他电活性的物种具有较高的选择性，例如３，４⁃二羟基苯乙酸、尿酸和５⁃羟基色胺。此电极具有高的选择性和良好的重现性。因此，可以选择性来检测鼠脑中的抗坏血酸含量。

图３循环伏安法测量纹状体中抗坏血酸含量的实验步骤［１１］。碳纤维微电极的扫描电子显微镜图（Ａ）修饰多壁碳纳米管之前；（Ｂ）修饰多壁碳纳米管之后；比例尺为１μｍ

Öｚｅｌ团队［５７］用壳聚糖修饰的碳纤维微电极对血清素进行选择性检测。图４显示没有任何修饰的碳纤维微电极与壳聚糖修饰的碳纤维微电极在活体中检测的对比。实验表明用未修饰碳纤维微电极记录的氧化峰包含了抗坏血酸和血清素的电化学信号，而壳聚糖包被的碳纤维微电极可排除抗坏血酸的干扰。与未修饰碳纤维微电极相比，包被壳聚糖的碳纤维微电极对血清素具有一定的选择性和较高的灵敏度。使用该微传感器可测量出低浓度的血清素，检出限为１.６ｎＭ。活体中的结果表明，在高空间和时间的分辨率下，壳聚糖修饰的电极可检测斑马鱼肠中血清素［５７］。

图４未修饰的碳纤维微电极和壳聚糖包被的碳纤维微电极在活体检测后的微分脉冲伏安图［５７］

除了金属材料微电极，贵金属微电极在活体检测中也具有非常重要的作用。本课题组［１２］通过湿沉积技术制备金环微电极，用３⁃巯基丙酸修饰的金环微电极可以实现实时监控活体鼠脑中儿茶酚胺的释放，如图５［１２］。

图５３⁃巯基丙酸修饰的金环微电极记录鼠脑纹状体中儿茶酚胺的释放量［１２］。（Ａ）在０.２Ｖ电压下修饰３⁃巯基丙酸之前（黑线）和修饰３⁃巯基丙酸之后（红线）检测多巴胺的Ｉ⁃ｔ图；（Ｂ）３⁃巯基丙酸修饰的金环微电极记录鼠脑纹状体中儿茶酚胺的释放

Ｃｈｅｎ等［４３］使用金纳米粒子和自组装单分子层修饰铂微电极监控帕金森疾病的动物模型中的多巴胺消耗量，结果表明，可提高检测多巴胺的灵敏性和特异性，并且减小抗坏血酸的干扰。用此微电极检测到多巴胺浓度线性范围为０.０１～５μＭ，线性相关系数为０.９９。

Ｓｈｉ等［５８］制备出一种全氟磺酸修饰的覆盖有金纳米粒子的玻璃毛细管作为微电极并成功应用于鼠脑纹状体中多巴胺的选择性检测，如图６所示。

图６全氟磺酸修饰金纳米粒子玻璃毛细管实时检测鼠脑中的多巴胺含量［５８］。通过注射２０ｍｇ·ｋｇ－１的氨苯甲异喹使鼠麻醉，使用全氟磺酸修饰金纳米粒子玻璃毛细管实时监测鼠脑中多巴胺含量的Ｉ⁃ｔ图。箭头显示氨苯甲异喹的注射时间

Ｂａｒｂｏｓａ等［５９］报道了一种包含４个铂响应点的覆盖葡萄糖氧化酶的微电极阵列传感器，如图７所示。该传感器用于检测鼠脑中葡萄糖含量，具有高选择性、灵敏性和稳定性良好等特点。

图７包含４个铂响应点并覆盖葡萄糖氧化酶的微电极阵列传感器的示意图［５９］

微电极还可以设计为电位型微型传感器进行活体检测研究。Ｍａｏ等［２３］基于碳纤维微电极制备了质子选择性微电极监测鼠脑中ｐＨ值的变化。该电极是将含有增塑剂、氢离子载体和离子交换剂的聚氯乙烯聚合物基质修饰于碳纤维微电极。该微电极具有很高的抗蛋白质污染性能，能够维持对ｐＨ值监测的灵敏性和可逆性，在范围较小的ｐＨ值变化（６.０～８.０）中表现出很好的响应。此电极可以实时监控活体ｐＨ值变化过程。Ｇｏｄａ课题组［２４］设计了一种Ｉｒ／ＩｒＯｘ离子选择性微电极，在其表面非特异性吸附牛血清蛋白后监测其电位响应。此电极在吸附蛋白质之后，在较宽的ｐＨ值范围内依然具有一定的电位响应，并且对蛋白污染具有一定耐受性，可直接用于含有生物分子的实际样品中的电位测量。

总之，通过在碳纤维微电极、金微电极、铂微电极等微电极表面修饰多壁碳纳米管、３⁃巯基丙酸、金属纳米粒子等物质之后，可以实现高灵敏、高选择地检测活体中的抗坏血酸、多巴胺等神经递质类物质，检出限低至ｎＭ级别，同时还可以应用于电位型传感方面的研究。

４.２单细胞检测

不管是非金属微电极还是贵金属微电极都可以用来实现单细胞检测。Ｗｉｇｈｔｍａｎ和Ｅｗｉｎｇ等构筑了一种圆柱形碳纤维微电极［６０，６１］，可用于电化学定量分析检测肾上腺嗜铬细胞瘤细胞和鼠脑组织中释放的神经递质物质。Ａｄａｍｓ等［６２］使用金纳米粒子网状形成的碳纤维微电极作为一种新的微电极传感器，成功检测出单细胞分泌的多巴胺。这种用来检测大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞分泌的多巴胺新型微电极，如图８所示。该微电极具有使用寿命长、稳定性良好等优点，并能显著降低电极表面与多巴胺的聚合作用。更为重要的是，由于金纳米粒子本身具有较强的惰性、弱的化学吸附作用、形成溶胶⁃凝胶网状时的高度稳定性、以及纳米粒子网状独特的３Ｄ结构等特殊性质，可大幅度提高传感器的灵敏度。

图８碳纤维微电极与金纳米颗粒网状电极检测单细胞胞外释放的多巴胺［６２］

本课题组［３６］报道了一种新型、简便的方法来制备碳环微电极阵列。这类微电极阵列应用于单一嗜铬细胞瘤胞外分泌多位点传感时，可检测出单一的神经元细胞或细胞网络。其制备过程简单、快速，如图９所示。此外，还可调控阵列管中电极的数量，已报道出单一的阵列顶端可容纳８～１５个电极。这些电极具有十分良好的电化学性能和重现性，使得其在单细胞分析检测方面具有常规微电极无可比拟的优点。

图９碳环微电极阵列用于细胞检测［３６］

使用火焰刻蚀法制备微电极实现单细胞检测也是当下的一个研究热点。利用该方法制备出的微电极电化学活性面积较大，可直接插入到细胞里进行检测［６３］。相比圆柱形的碳纤维微电极，这些电极具有更高的灵敏度，能显著改善动力学参数并对神经递质具有快速的响应［６４］。Ｅｗｉｎｇ等［１４］将具有纳米尺寸尖端的碳纤维微电极直接应用于检测肾上腺嗜铬细胞瘤细胞中分泌的儿茶酚胺量，如图１０所示。对于细胞内的测量来说，尖端纳米尺寸的圆锥形碳纤维微电极可以穿过细胞膜并对膜没有损坏。

图１０顶端纳米尺寸的碳纤维微电极检测单个肾上腺嗜铬细胞瘤细胞显微镜图［１４］。（ａ）示意图（橙色的小圆圈代表囊泡）；（ｂ）尖端为纳米尺寸的圆锥形的碳纤维微电极检测单个肾上腺嗜铬细胞瘤细胞显微镜图

微电极作为电位型传感还可以应用在单细胞检测中，Ｎｇ等［２５］报道氧化铱微电极用于监测内皮细胞中急性、局部的ｐＨ值变化，可实时监测代谢反应，有助于实时监测细胞的相互作用。Ｔｈｕｎｄａｔ课题组［２６］制备了一种灵敏、生物相容性好的纳米纤维电位型传感器，可用于研究癌细胞的代谢活动，还可实时监测细胞外的ｐＨ值变化。同时，它可用于监测癌细胞的化学耐药性，对未来发展新的抗癌药物具有潜在意义。

微电极不仅能够检测生命系统中的神经递质类物质，还能检测一些生命体能量代谢物质和调质类小分子物质及自由基等。

基于铂纳米粒子对过氧化氢良好的电化学催化作用［６５］，Ｈｕａｎｇ等［１３］报道了一种金／铂粒子混合纳米结构自组装的金微线微电极，发展了一种高灵敏度、高空间和高时间分辨率的传感器应用于人类乳腺癌细胞内过氧化氢的检测。电催化可还原过氧化氢，检出限低至０.３ｎＭ。微电极超小的几何尺寸、高灵敏度，能够实时准确监控出乳腺癌细胞中过氧化氢的释放，如图１１所示。基于以上特点，微电极已经在生理学和病理学的应用方面展现出良好的发展前景。Ｚｈｅｎｇ等［６６］制备钯纳米粒子包被的碳纳米管纤维微电极进而检测过氧化氢含量，其检测过程响应快速（２ｓ），检出限低至２μＭ，该电极对过氧化氢的检测具有高灵敏度和选择性。Ｗａｎｇ等［６７］通过电沉积方法在碳纤维微电极上沉积铂纳米粒子制备出的电极，对于过氧化氢具有一定的催化能力，检测范围宽（０.０４４～１２.３０ｍＭ），进而可以检测出细胞瘤释放的过氧化氢含量。

图１１金／铂粒子混合纳米结构的微电极检测乳腺癌细胞释放的过氧化氢Ｉ⁃ｔ曲线［１３］。（ａ）在丙二醇甲醚醋酸酯（ＰＭＡ）刺激下从６个ＭＣＦ⁃７细胞中释放Ｈ２Ｏ２；（ｂ）从单个ＭＣＦ⁃７细胞中释放Ｈ２Ｏ２；（ｃ）细胞与过氧化氢酶孵化之后在ＰＭＡ刺激之后ＭＣＦ⁃７细胞释放过氧化氢；（ｄ）在磷酸缓冲盐溶液刺激下ＭＣＦ⁃７细胞释放过氧化氢

一氧化氮是神经、心血管系统细胞间进行信息传递的重要调节因子，作为第二信使和神经传递物质在生命体系中同样发挥着重要的角色。发展一种快速并且具有一定灵敏性的传感器在生物体中检测一氧化氮具有十分重要的意义。目前，光学和电化学方法是检测一氧化氮的两种主要方法［６８～７０］。电化学传感器具有检出限低、响应快速、制备简单、尺寸小等特点，并且在生物样品中能够实时监测一氧化氮的浓度［７１～７３］，因此，发展电化学传感器来高效、灵敏地检测一氧化氮引起了人们的广泛兴趣。

金属纳米材料具有较快的电子传递和一定催化效果等特点，被广泛用来合成传感器监测一氧化氮的释放。目前，已经构筑出金纳米粒子、铂纳米粒子类的传感器来检测一氧化氮。贵金属具有优异的特性，近几年来被广泛应用在不同的领域［７４，７５］。其中，金属纳米材料具有较快的电子传递和催化效果等特点，被广泛用来制备传感器监测一氧化氮的释放，例如已经构筑出金纳米粒子［７６，７７］、铂纳米粒子［７８］类的传感器来检测一氧化氮。Ｈｕ等［７９］通过一种简单的化学液相沉积法在石英纤维上生长金纳米粒子薄膜，制备出了一种新型的金纤维微电极。通过电聚合上烟酰胺和全氟磺酸后，这种一氧化氮微传感器灵敏度高、检出限低至３.６ｎＭ，可成功用于检测小鼠肝细胞中的一氧化氮的释放。Ｈｅｎｒｙ等［８０］制备铂微电极来检测一氧化氮，进一步提高了电极抗污染能力，检测限为９０ｎＭ～１μＭ。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等［８１］使用金纳米粒子修饰的碳超微电极阵列，对一氧化氮的检测具有一定的选择性和灵敏度，并且此电极对于一氧化氮氧化具有一定的催化能力。

针对单细胞检测，对于电极的尺寸和性能有更高要求，微电极可适用于单细胞物质检测的诸多方面。相比贵金属微电极，因其具有良好的生物相容性和较低的制作成本，碳纤维微电极更适用于单细胞检测。此外，通过在贵金属微电极表面修饰上纳米粒子也可以实现低检测限检测过氧化氢、一氧化氮等小分子。


５结论

随着电子技术的高速发展，制备出的微电极最小极限直径在不断减小。但是在实际生物样品检测过程中，微电极表面易发生吸附、钝化等物理现象以及传质过程引起的扩散、对流、电渗透等电化学现象，都会不同程度的影响检测时的灵敏度和选择性。另外，在电极表面修饰的某些材料会因时间推移而褪去，从而降低微电极的性能。关于实际检测过程中碳纤维的降解是否会改变电极的响应；如何减小活体分析时微电极的植入对于组织造成的不可避免的损伤；活体检测的复杂性及待测物质与干扰物质相互影响作用等问题仍然亟待解决［５］。

目前，微电极的发展更侧重对微小尺度结构的研究［８２］，微电极的发展趋势是制备出纳米级别的电极，进而独立发展成纳米电子学学科［８３］。此外，可将成熟的金、铂微电极的制备方法拓展到其他金属材料上，以进一步开展新的微纳传感器应用研究。通过改进已有的制备技术，集成具有高通量分析性能的微电极阵列可同时检测和分析多种组分。研究如何实现微电极的传感器尺寸的纳米化，并应用在单细胞与活体分析研究中，可以使得微传感器呈现出更多的生物分析空间兼容性，从而在基础生物学和医疗领域中发挥更大作用。另外，可以扩展微电极材料的范围至更多功能性材料或者扩展成３Ｄ结构，实现微电极在更多的领域中发挥出最大的价值。