摘要


功能化基团通常附着在单壁碳纳米管（SWNT）的表面，以改善其突出的特性，从而获得更广泛的应用。然而，羟基修饰的单壁碳纳米管对反硝化微生物的潜在影响尚不清楚。在本研究中，通过使用脱氮副球菌作为模型反硝化微生物，研究了单壁碳纳米管OH对反硝化的影响。与原始单壁碳纳米管相比，50mg/L单壁碳管OH的存在显着降低了反硝化效率，从99.3%降至75.0%。机制研究表明，单壁碳纳米管OH抑制了负责糖酵解的关键酶，这是由于分散性的增加、与酶蛋白的结合电位、与膜相互作用的可能性以及活性氧物种的产生。因此，反硝化细菌利用碳源（葡萄糖）的代谢受到严重干扰，随后细菌的生长和反硝化电子供体（NADH）的生成下降。进一步的研究表明，单壁碳纳米管OH还降低了硝酸还原酶的活性。单壁碳纳米管OH释放到环境中可能会对生物圈中的氮循环造成严重干扰。

1.导言


在过去几十年中，大量具有特定物理化学特性的工程纳米材料已经制造出来，这些纳米材料的各种应用正在开发[1-3]。在各种纳米材料中，单壁碳纳米管（SWNT）是一种具有单层石墨烯的圆柱形碳纳米材料，自1991年首次发现以来已经流行了近二十年[4]。单壁碳纳米管的特殊结构决定了其特殊的电气、化学、机械和热特性，这使得其在许多领域的潜在应用不断增长，如复合材料科学、电子学、水净化和生物技术[5,6]。通常，由于碳纳米管之间存在强烈的范德华相互作用，碳纳米管的溶解性和分散性较差[7]。为了改善其性能以满足所需的应用，表面官能团连接到单壁碳纳米管是普遍的。到目前为止，大量的无机或有机基团，甚至生物分子（如牛血清白蛋白）附着到单壁碳纳米管的表面，以实现特殊目的[5]。在官能化碳纳米管中，具有羟基官能团的单壁碳纳米管（SWNT-OH）因其改善的生物、机械和其他性能而被广泛应用[8]。


随着与碳纳米管相关产品的制造和应用的增加，越来越多的单壁碳纳米管将被释放到环境中[9]。释放的单壁碳纳米管可能会影响环境微生物的活性。在文献中，大量研究集中于碳纳米管对模型微生物（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）活力丧失的毒性作用[10-12]。此外，碳纳米管对环境中微生物的影响也引起了更多的关注。例如，发现碳纳米管的暴露会导致功能丧失，并对污泥、水生沉积物和土壤中的微生物群落产生影响[13–16]。此外，据报道，细菌土壤群落受到单壁碳纳米管的影响，这可能干扰土壤中的养分循环[17]。Shrestha等人发现，参与氮、碳和磷循环的酶的代谢活性受到多壁碳纳米管的影响[18]。由于碳纳米管对环境过程的负面影响，应研究原始和功能化碳纳米管对氮循环的影响，因为单壁碳纳米管的毒性受到官能团的强烈影响[19]。


氮是存在于土壤、大气和生物体中的重要元素，氮循环是生物圈中的基本生物地球化学过程之一。在氮循环中，各种化学形式的氮之间的转换与气候变化、土壤肥力和水质具有重要相关性。在氮循环的复杂步骤中，反硝化是将氮从硝酸盐转化为气态氮以维持氮平衡的唯一途径，该过程可能导致水生和土壤系统中氮的损失，并伴随产生一氧化二氮（N2O），这是一种温室气体。因此，对反硝化的任何负面影响都将打破氮平衡，干扰全球气候[20,21]。


据报道，反硝化作用会受到多种环境污染物的干扰，如重金属和工程纳米颗粒[22–26]。例如，文献中观察到氧化物纳米颗粒（如ZnO、SiO2和Al2O3纳米颗粒）抑制活性污泥中的反硝化还原酶，这进一步导致更多硝酸盐积累[24–26]。此外，据报道，stutzeri假单胞菌的反硝化过程受到量子点的负面影响[23]。众所周知，反硝化过程包含一系列的氧化还原反应，其中硝酸盐通过获取电子逐步还原，因此反硝化主要依赖于电子转移。在电子转移链中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和还原烟酰胺腺苷酸二核苷酸（NADH）的转化在碳源代谢和反硝化过程之间起着至关重要的作用[27]。此外，许多关键酶参与碳源代谢和反硝化反应。酶和NADH都是生物大分子，据报道，单壁碳纳米管与某些大分子（如蛋白质和胶原）相互作用[28,29]。因此，有必要研究单壁碳纳米管对反硝化细菌代谢和功能的影响，特别是从酶活性方面。


本研究以脱氮副球菌为模型反硝化微生物，研究了单壁碳纳米管OH对反硝化的影响。此外，从细胞膜完整性、氧化应激反应、减少发电量、细胞增殖以及参与糖酵解和反硝化反应的关键酶的活性等方面探讨了单壁碳纳米管OH显着抑制反硝化过程和碳源代谢的潜在机制。


2.材料和方法


2.1.反硝化细菌


P、从ATCC购买的反硝化菌（ATCC 19367）被选为测试细菌，因为它广泛存在于水生和土壤环境中，并且反硝化代谢已得到充分了解[27]。在暴露实验之前，将微生物在30°C的Difco营养肉汤中，在振动筛中进行有氧培养，持续搅拌（200 rpm）过夜。培养24小时后，根据我们先前的出版物[30]，在早期稳定生长阶段收获细胞。简而言之，通过在5000 rpm下离心10分钟收获细胞，用0.1 M PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤3次，然后再悬浮在同一缓冲液中。


2.2.单壁碳纳米管和单壁碳管OH本体溶液的制备


单壁碳纳米管和单壁碳管OH购自中国南京XF纳米科技港口有限公司，单壁碳钢管OH由制造商从原始单壁碳氮管氧化而成。对于暴露实验，根据文献[31]处理单壁碳纳米管和单壁碳管OH。将纳米管置于12 M HCl溶液中8小时以除去残留的金属催化剂，用大量Milli-Q水洗涤至中性pH，然后在烘箱（60°C）中干燥过夜，以获得粉末状单壁碳纳米管和单壁碳管OH。在接下来的暴露实验之前，将0.025g制备的粉末状碳纳米管添加到50 mL Milli-Q水中，并将原料悬浮液（500 mg/L）超声处理1小时（25°C，250 W，40 kHz）。


2.3.单壁碳纳米管和单壁碳管OH的表征


通过透射电子显微镜（TEM）技术确定了单壁碳纳米管和单壁碳管OH的形态和尺寸，并使用FEI-Titan FEG-TEM收集图像。简言之，碳纳米管粉末在乙醇中充分分散，一滴悬浮液放置在铜网格上。然后，让网格在成像之前干燥。使用Brunauer–Emmett–Teller（BET）方法测量了单壁碳纳米管和单壁碳管OH的比表面积（SSA），数据分别为280和244m2/g。在Mastersize 3000（英国马尔文）中，通过动态光散射（DLS）测量了单壁碳纳米管和单壁碳管OH的直径分布，并通过Zetasizer Nano ZS 90（英国马尔温）测定了zeta电位。


使用Jobin Yvon XploRA fdu激光拉曼分光光度计获得了单壁碳纳米管和单壁碳管OH的拉曼光谱，入射波长为532nm。单壁碳纳米管和单壁碳管OH的拉曼光谱分别在1342和1583cm1处显示D带和G带。对于每个样品，绘制光谱曲线，并在G带归一化后计算ID/IG。


通过X射线光电子能谱（XPS）测定元素组成和表面官能化百分比。从PHI 5000C ESCA系统（Perkin–Elmer）中收集数据，Mg目标压力为14.0 kV，功率为300 W。单壁碳纳米管和单壁碳管OH样品均采集0–1200 eV全扫描光谱（通过能量为93.9 eV），然后收集相关元素以获得窄轨扫描光谱。最终结果由AugerScan 3.21软件分析，C1s=284.6eV作为结合校正的基准。


通过热重分析（TGA）研究了酸处理前后催化剂残留量的变化。数据由Discovery TGA收集，温度范围为200–1000℃，上升速率为10°C/min，在流动空气中。质量损失百分比和质量速率曲线显示了酸预处理的成功，并对每毫克样品的曲线进行了归一化。


2.4.暴露于单壁碳纳米管和单壁碳管OH的反硝化细菌的实验


在这项研究中，反硝化细菌暴露于0、10和50mg/L的碳纳米管中。暴露实验在含有矿物质培养基的血清瓶中进行。矿物培养基根据参考标准制备，稍加修改（g/L）：葡萄糖，5.0；K2HPO4，7.0；KH2PO4，3.0；柠檬酸钠2H2O，0.5；MgSO47H2O，0.1；（NH4）SO4，1.0；KNO3、2.16和50微升/升的微量元素溶液[32]。所含微量元素（g/L）：CaCl22H2O，7.4；MnSO4H2O，1.0；ZnSO47H2O，3.6；CoCl26H2O，0.4；FeCl36H2O，0.96；CuCl22H2O，0.03；H3BO3，0.3；NiCl26H2O，0.01；EDTA-Na2，3.7。初始硝酸盐浓度为300mg NO3-N/L。根据文献[23]，硫酸铵用于阻止同化硝酸盐的还原，并确保硝酸盐的消耗是由呼吸引起的。对所有瓶子和相关设备进行消毒，然后用紫外线消毒20分钟。添加单壁碳纳米管或单壁碳管OH散装溶液后，添加细菌悬浮液，以确保每个瓶子的初始OD600值为0.05。将氩气吹扫到每个瓶子中10分钟，以确保厌氧条件。密封后，将所有瓶子放置在恒温30°C的摇床（200 rpm）中。


细胞生长由光密度OD600值确定，该值在曝光实验期间每4小时测量一次。由于碳纳米管在600nm处的光吸收，OD测量中用于校正背景的空白是添加了单壁碳纳米管或单壁碳管OH的矿物介质。减去碳纳米管空白后，通过绘制OD600数据与时间的对比图生成OD生长曲线[33,34]。


培养基中NO3、NO2和N2O的浓度每隔4小时测量一次，总时间为24小时。NO3和NO2的测量由分光光度计根据标准方法进行[35]。反硝化梭菌产生的N2O由带有电子捕获检测器（ECD）的气相色谱仪（GC）（安捷伦7820A，美国）测定。直接对气体中的N2O进行采样，并通过注射器将其注入GC的样品入口，在平衡温度和时间分别为25°C和3小时的顶空下检测水溶液中的N2O[36]。


2.5.暴露于SWNT和SWNT OH的反硝化细菌对葡萄糖的利用


测量了暴露于单壁碳纳米管和单壁碳管OH的反硝化梭菌对葡萄糖的利用率，该方法符合先前的出版物[37]。为了消除葡萄糖吸附在碳纳米管上造成的偏差，通过减去碳纳米管吸附的葡萄糖来计算消耗的葡萄糖浓度。如下检测单壁碳纳米管和单壁碳管OH（10和50mg/L）对葡萄糖的吸附。除不添加反硝化细菌外，具体程序与暴露试验相同。获得样品并以12000 rpm（5分钟）离心，上清液用于测试剩余葡萄糖浓度。碳纳米管吸附的葡萄糖是初始葡萄糖和剩余葡萄糖浓度之间的差异。


2.6.酶活性的测定


暴露24小时后，制备粗细胞提取物用于酶活性测定。通过以5000rpm离心10分钟收获细胞，用100mM PBS（pH 7.4）洗涤两次，然后再悬浮在相同的缓冲液中。通过在20 kHz下超声处理5分钟来破坏悬浮液5分钟，然后通过在12000 rpm下离心10分钟来去除细胞碎片。上述操作在4°C下进行。粗细胞提取物立即用于测定特定酶活性，细胞提取物中的蛋白质含量通过Lowry等人的方法测定，以牛血清白蛋白为标准[38]。酶活性被定义为每分钟每毫克蛋白质的转化底物量（以1mol min1 mg#1表示），这表明酶活性是基于相同的蛋白质含量进行比较的。


己糖激酶（HK）、6-磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK）活性的测定根据文献[39]进行。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）活性通过从Sciencell Research Laboratories（美国）购买的检测试剂盒进行测量。首先，根据文献或说明书制备分析混合物以供后续使用。然后，加入50ll细胞提取物以开始反应，并每30秒记录340nm处的吸光度，持续3分钟。特定酶活性测定为吸光度变化梯度除以蛋白质含量。


关键反硝化酶（包括硝酸还原酶（NAR）、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶）的活性测定根据我们之前的出版物[30]进行。简而言之，测定混合物包含10mM PBS缓冲液（pH 7.4）、1mM甲基紫精、5mM Na2S2O4和1mM反应电子受体（KNO3、NaNO2、NO或N2O）。所有上述物质均从储备溶液或饱和溶液（如NO和N2O）中稀释。饱和溶液（NO为2.0 mM，N2O为25 mM）是通过连续5分钟将纯NO或N2O气体吹扫到Milli-Q水中来制备的。应注意的是，有关NO的所有操作都是在厌氧环境下进行的，或者NO的Ar保护很容易被氧氧化[40]。通过向测定混合物中加入0.3 mL粗细胞提取物开始反应。然后立即将混合物放置在30°C培养箱中，每10分钟收集一次数据。具体而言，通过分光光度计检测亚硝酸盐浓度的增加或减少，以进行NAR和NIR测量，并通过NOR和N2OR的相应微传感器（丹麦Unisense）记录混合物中一氧化氮或一氧化二氮的消耗量。NAR和NIR的活性分别表示为lmol亚硝酸盐/（min-mg蛋白）的产生和减少；对于NOR和N2OR，酶活性的单位分别为1mol一氧化氮/（min-mg蛋白质）和lmol氧化亚氮/（min-mg蛋白质）的消耗量。


2.7.NAD+和NADH测定


详细程序根据文献[41]进行。将重复样品（各1ml，一个用于NAD+测量，另一个用于NADH测量）在12000 rpm下离心5分钟。然后去除上清液，并添加300 lL 0.2 M HCl（用于NAD+提取）或0.2 M NaOH（用于NADH提取）以重新悬浮颗粒。将样品置于50℃水浴中10分钟，然后用冰冷却至0℃。通过在旋转的同时滴加300升0.1 M NaOH（用于NAD+提取）或300升0.1 M HCl（用于NADH提取）来中和提取物。通过在15000 rpm下离心5分钟除去细胞碎片。立即将上清液转移到新试管中进行测量。


通过酶循环测定法测定细胞内NADH和NAD+浓度。循环试验混合物由等体积的1.0 mM Bicine缓冲液（pH 8.0）、乙醇、40 mM EDTA（pH 8.0）、4.2 mM噻唑蓝（MTT）和两倍体积的16.6 mM乙醇硫酸吩嗪（PES）组成，然后在30°C下孵育10分钟。反应混合物的制备如下：50 lL中和细胞提取物、0.3 mL蒸馏水和0.6 mL试剂混合物。通过加入50ll乙醇脱氢酶（ADH，500U/mL）开始反应。在30℃下每30秒检查570 nm处的吸光度10分钟。NADH和NAD+的浓度用0.01–0.05mM NADH与NAD+标准溶液校准。最终的NAD+与NADH水平按毫克蛋白质计算。


2.8.反硝化梭菌的细胞膜完整性和活性氧产生


根据制造商的说明，使用细胞毒性检测试剂盒（罗氏应用科学公司）测量乳酸脱氢酶（LDH）释放，以研究反硝化梭菌的细胞膜完整性。暴露于SWNT和SWNT OH后，制备培养上清液并将其接种在96孔板上，然后添加50 lL底物混合物（罗氏应用科学）。然后，在室温下孵育30分钟后加入50 lL stop溶液（罗氏应用科学公司），并使用微孔板读取器（BioTek，USA）在490 nm吸光度下获得数据。根据先前的出版物[24]，通过扫描电子显微镜（SEM）图像分析了反硝化细菌暴露于单壁碳纳米管或单壁碳管OH后的表面形态。


碳纳米管诱导的细胞内活性氧（ROS）产生通过荧光分析测定[42]。培养24小时后，通过5000 rpm离心5分钟收集细菌，然后用0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤三次。将颗粒重新悬浮在含有50lm二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA，分子探针，Invitrogen）的0.1M磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在30°C厌氧培养箱中黑暗中放置30分钟。通过离心除去PBS后，将细菌重新悬浮在包含浓度分别为0、10和50mg/L的SWNT或SWNT OH的矿物培养基中，然后在厌氧条件下在96孔板中孵育24小时，然后用485nm激发和520nm发射滤光器由微孔板读取器（BioTek，USA）检测。


2.9.统计分析


所有试验一式三份，结果以平均值±标准偏差表示。方差分析（ANOVA）用于检验结果的显着性，p<0.05被认为具有统计学意义。


3.结果和讨论


3.1.单壁碳纳米管与单壁碳管OH之间影响脱氮性能的比较


碳纳米管的环境行为和毒性取决于尺寸、纯度、表面积和表面化学等性质[43]。在暴露实验之前，本研究采用了几种表征方法，以提供单壁碳纳米管和单壁碳管OH的准确信息。图1a和b显示了单壁碳纳米管和单壁碳管OH的TEM图像，单管直径在3-5nm范围内。在图1c中，通过XPS光谱提供了单壁碳纳米管和单壁碳管OH的元素组成，结果表明，单壁碳管OH的氧含量（6.53%）高于单壁碳氮管（0.57%），这表明单壁碳核管OH表面存在羟基。此外，拉曼光谱显示在图1d中，G带归一化后显示D带和G带。这些谱带的强度比（ID/IG）表明了功能化程度，更高的ID/IG比意味着CNT表面的共价功能化程度更高[44]。在本研究中，单壁碳纳米管和单壁碳管OH的ID/IG比分别为0.09和0.30，这证明了单壁碳氮管OH上存在共价官能团。为了测定碳纳米管中的残余金属含量，采用TGA分析获得图1e中的质量损失曲线。一般而言，当碳纳米管样品加热至600°C或更高温度时，含碳成分被去除，剩余质量包含催化金属及其氧化。从TGA曲线来看，酸处理后的单壁碳纳米管残留质量百分比较低，表明酸处理成功去除了金属催化剂。

图1.通过各种技术对单壁碳纳米管和单壁碳管OH样品的表征。（a）单壁碳纳米管的TEM图像；（b）单壁碳纳米管OH的TEM图像；（c）SWNTs和SWNTs OH的XPS光谱（534eV是氧元素的对应位置）。（d）G-带归一化后的单壁碳纳米管和单壁碳管OH的拉曼光谱。（e）酸处理前后单壁碳纳米管的热重分析以及最终稳定质量百分比是由于金属催化剂的存在。


暴露24小时后，如图2a所示，对照组以及10和50 mg/L单壁碳纳米管试验中的NO3-N浓度分别为3.1、3.8和3.0 mg/L，相应的硝酸盐去除效率分别为99.0%、98.7%和99.0%，这表明10或50 mg/L单壁碳管的存在对脱氮没有显着影响（p>0.05）。然而，当细胞暴露于10mg/L的单壁碳纳米管OH时，最终硝酸盐浓度为44.5mg/L，NO3-N去除效率降低至85.2%。进一步增加单壁碳纳米管OH至50 mg/L会导致反硝化性能大大降低，最终NO3 N浓度和去除效率分别为74.9 mg/L和75.0%。因此，在本研究所研究的剂量下，羟基官能化单壁碳纳米管抑制了反硝化细菌的硝酸盐还原过程。然而，从图2b中可以看出，在添加单壁碳纳米管或单壁碳管OH后，亚硝酸盐和一氧化二氮的变化接近于对照，并且在暴露24小时后，所有实验中的最终亚硝酸盐与一氧化二氢几乎相同（接近零）。单壁碳纳米管或单壁碳管OH的存在似乎没有干扰反硝化过程中亚硝酸盐和一氧化二氮的生物还原反应。在下文中，研究了单壁碳纳米管OH抑制反硝化细菌硝酸盐还原的机理。

图2.在24小时暴露试验期间，单壁碳纳米管和单壁碳管OH对NO3-N（固体，a）、NO2-N（空心，a）和N2O（b）变化的影响。误差条表示三次测量的标准偏差。


3.2.单壁碳纳米管OH影响反硝化细菌脱氮的机理


通常，由于高比表面积和生物活性，纳米材料很可能附着到细胞表面，细胞与纳米材料之间的物理接触已经得到证实[45]。在此，图3显示了反硝化梭菌在与50mg/L的单壁碳纳米管或单壁碳管OH接触24小时后的细胞形态的SEM图像。可以看出，单壁碳氮纳米管和单壁碳T OH附着在球形反硝化梭鱼的表面上。与对照组相比，暴露于SWNT和SWNT OH的细胞仍保持完整的形态。文献中使用LDH释放分析来研究纳米材料对细胞结构完整性的影响[24]，结果（图4）表明，在不存在和存在碳纳米管的情况下，LDH释放没有显着差异（p>0.05）。因此，10或50 mg/L的单壁碳纳米管或单壁碳管OH的存在不会引起反硝化梭菌细胞膜的损伤和细胞质的渗漏。



图3.反硝化梭菌暴露于0（a）和50 mg/L单壁碳纳米管（b）和单壁碳管OH（c）24小时的SEM图像。

图4.反硝化梭菌在与单壁碳纳米管或单壁碳氮纳米管接触24小时后的乳酸脱氢酶释放。误差条表示三次测量的标准偏差。统计分析表明，对照组与单壁碳纳米管或单壁碳管OH添加之间的差异不显着（p>0.05）。


即使细胞结构没有被单壁碳纳米管或单壁碳管OH破坏，但仍不清楚是否会影响细菌的代谢。本研究采用葡萄糖作为碳源，初始浓度为5g/L。作为优秀的吸收剂，碳纳米管将吸附培养基中的有机分子，这应在毒性试验中予以考虑[46]。在培养基中，对于10mg/L单壁碳纳米管、50mg/L单体碳纳米管、10mg/L单壁碳管OH和50mg/L单体碳管OH，吸附部分与总葡萄糖的比率分别为1.22%、2.67%、1.07%和2.42%，因此吸附的葡萄糖占总葡萄糖的很小部分。在用单壁碳纳米管和单壁碳管OH减去吸附的葡萄糖后，计算反硝化细菌利用的葡萄糖，如图5b所示。培养24小时后，在10或50 mg/L原始单壁碳纳米管存在下的利用葡萄糖浓度几乎与对照相同。然而，当暴露于10mg/L的单壁碳纳米管OH时，反硝化梭菌对葡萄糖的利用较少，这表明单壁碳管OH抑制了葡萄糖的利用。根据图5b，当单壁碳纳米管OH的剂量为50mg/L时，抑制效果进一步增强。

图5.葡萄糖转化途径的示意图（a），以及单壁碳纳米管和单壁碳管OH暴露24小时对利用葡萄糖浓度（b）、参与糖酵解的关键酶的相对活性（c）和细胞内NADH/NAD+比率（d）的影响。误差条表示三次测量的标准偏差。


为了找出单壁碳纳米管OH抑制葡萄糖利用的原因，研究了一些参与葡萄糖代谢的关键酶。葡萄糖在细菌中的代谢（即糖酵解）是一个复杂的过程，具体转化如图5a所示。甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）是催化甘油醛3-磷酸酯（G-3-P）转化为1,3-二磷酸甘油酯（1,3-BPG）的重要酶，是葡萄糖Embden-Meyerhof途径中生成NADH的唯一步骤。据报道，GAPDH的比活性受到环境因素的负面影响，如碳源、重金属离子和氧化应激，这可能导致糖酵解活性降低[47–49]。图5c表明，10 mg/L和50 mg/L的单壁碳纳米管OH处理引起的GAPDH活性分别为对照的72.0%和43.8%，这表明单壁碳管OH诱导了GAPDH的失活，并且随着单壁碳氮纳米管OH剂量的增加，副作用增大。此外，葡萄糖转化途径中存在三种不可逆反应，三种激酶（即己糖激酶（HK）、6-磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK））在这些步骤中起着至关重要的作用。激酶是一种将磷酸基团从高能供体分子转移到特定底物的重要酶，负责细菌生长和代谢过程中的能量转换和产生。从图5c中的数据可以看出，单壁碳纳米管（10或50 mg/L）的暴露不会导致这些酶活性的显著损失（p>0.05）。然而，在10或50 mg/L单壁碳纳米管OH存在下，HK、PFK和PK的活性显著降低。例如，在50 mg/L单壁碳管OH暴露试验中，这些酶分别降低到对照的80%、72%和78%。对这些关键酶的抑制阻碍了糖酵解过程，因此，羟基官能化单壁碳纳米管的存在降低了葡萄糖的利用率。葡萄糖的利用是一个重要的生物过程，在能量代谢中起着重要作用。当细胞暴露于富勒烯衍生物（另一种碳基纳米材料）时，葡萄糖呼吸受到抑制，这解释了富勒烯对[50]的抑菌作用。此外，Kang等人研究了碳纳米管对大肠杆菌的抗菌作用，DNA微阵列数据表明与糖酵解相关的基因受碳纳米管调控[51]，这从基因水平证实了碳纳米管对于葡萄糖代谢的影响。


上述结果表明，单壁碳纳米管表面的共价羟基导致对糖酵解的抑制。羟基官能化可以改变碳纳米管的表面结构，进而影响其物理化学性质。下文从单壁碳纳米管的亲水性、氧化应力和羟基化后的极性表面能等方面阐明了原因。首先，亲水基团修饰的碳纳米管可以通过脂质辅助机制很容易与生物膜相互作用[52]。因此，与原始单壁碳纳米管相比，由亲水性极性基团羟基修饰的单壁碳管更容易与微生物相互作用。其次，活性氧生成过多被认为是单壁碳纳米管细胞毒性的一个重要原因[53]，活性氧的增加可能会抑制细胞能量产生过程（如糖酵解）[47]。在本研究中，反硝化梭菌暴露于单壁碳纳米管OH时产生更多的活性氧（见SD，图S1）。因此，由于ROS的产生，暴露于单壁碳纳米管OH时观察到葡萄糖利用率较低。此外，据报道，碳纳米管的羟基官能化显示出极性表面能的差异，并具有与基质化合物（如蛋白质）交联的更大潜力[54]，这将使蛋白质变性。众所周知，反硝化梭菌中存在许多酶，它们在细胞内代谢，特别是葡萄糖同化过程中发挥着重要作用。因此，负责糖酵解的酶很可能被单壁碳纳米管OH变性，这将干扰葡萄糖的利用。


碳源（即本研究中的葡萄糖）的代谢在反硝化微生物中起着重要作用，如电子转移链的运行和细菌的生长。P、反硝化菌利用有效而复杂的电子转移链实现细胞质、周质和膜的整个代谢[55]。高价氮化合物的还原取决于电子转移，最重要的电子转移介质是NAD+和NADH[27]。该辅因子对在微生物分解代谢中起主要作用，其中碳源使用NAD+氧化，并由GAPDH催化生成NADH形式的还原当量（图5a）。还原NADH和氧化NAD+之间的相互转化对于维持氧化还原平衡至关重要，NADH/NAD+比率是衡量细菌氧化还原状态的重要参数[41]。如图5d所示，10或50 mg/L的单壁碳纳米管OH显着干扰了细胞内NADH/NAD+比率，因为暴露于单壁碳管OH的细菌的NADH/NAD+比例远低于对照。因此，单壁碳纳米管OH的存在导致比对照和单壁碳管更具氧化性的环境，最终导致较低的脱氮效率。


由于单壁碳纳米管OH的存在对反硝化梭菌的葡萄糖代谢具有显着的抑制作用，因此细胞生长也可能受到影响。如图6所示，在适应阶段（0–8小时）后，微生物进入指数阶段，暴露于10或50 mg/L单壁碳纳米管的细菌显示出与对照几乎相同的生长曲线。即使在许多研究中，单壁碳纳米管对大肠杆菌和枯草杆菌显示出强烈的抗菌活性[11,34]，但单壁碳管的毒性行为取决于实验条件，如细胞类别、培养基组成和其他因素[56]，这一点仍不确定。例如，Arias和Yang发现，不同的介质组成会导致单壁碳纳米管对细菌的毒性表现不同[57]。因此，与其他研究不同，原始单壁碳纳米管在反硝化介质中没有显示出明显的毒性。在本研究中，对照试验的最终OD600值为1.461，在10 mg/L和50 mg/L单壁碳纳米管暴露试验中分别为1.458和1.470。然而，在10 mg/L和50 mg/L单壁碳纳米管OH存在下，最终OD600数据分别降至1.330和1.169。显然，单壁碳纳米管OH显着干扰了反硝化梭菌的生长，而原始单壁碳管不影响细胞生长。

图6.单壁碳纳米管和单壁碳管OH对反硝化细菌生长曲线的影响。误差条表示三次测量的标准偏差。


Pasquini等人发现，羟基化单壁碳纳米管比原始单壁碳管对大肠杆菌的细胞毒性更严重，因为羟基功能化诱导了更好的分散性和更小的尺寸，这归因于毒性的提高[31]。此外，在我们的研究中，单壁碳纳米管OH表现出比单壁碳管更稳定的状态和分散性，因为它们的zeta电位更负（图S2，SD）。更好的分散性意味着形成碳纳米管束的可能性更小，这导致观察到的尺寸更小。在本研究中，DLS分析表明，羟基化单壁碳纳米管的水力直径仅为介质中原始单壁碳管的64.2%。因此，羟基化碳纳米管由于更好的分散特性，导致对反硝化细菌的毒性升高。


在反硝化过程中，几个关键酶，如硝酸还原酶、亚硝酸盐还原酶，一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶分别催化硝酸盐还原为亚硝酸盐、亚硝酸钠还原为一氧化氮、氧化亚氮还原为氧化亚氮和氧化亚铁还原为氮。在我们之前的研究中，观察到氧化物纳米材料抑制了活性污泥中反硝化酶的活性[24–26]。如图7所示，与对照相比，单壁碳纳米管OH降低了硝酸还原酶（NAR）的比活性（p<0.05），但其他三种酶（NIR、NOR和N2OR）的比活度没有受到干扰（p>0.05）。对于四种反硝化酶，当细菌暴露于单壁碳纳米管OH时，观察到不同的反应，在其他研究中观察到类似的结果，即纳米材料仅抑制NAR的活性，而不是else反硝化酶[24]。显然，单壁碳纳米管OH的存在仅影响硝酸盐的还原，而对亚硝酸盐、一氧化氮和一氧化二氮的还原影响不大。这些结果与图2中的上述观察结果一致，即单壁碳纳米管OH导致反硝化系统中过量的硝酸盐积累，但亚硝酸盐和一氧化二氮的生成没有受到影响。

图7.在24小时的实验时间，单壁碳纳米管和单壁碳管OH对硝酸还原酶（NAR）、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶活性的影响。误差条表示三次测量的标准偏差。


4.结论


综上所述，由于参与糖酵解的关键酶活性较低，单壁碳纳米管OH暴露于反硝化梭菌会抑制葡萄糖利用的代谢，从而导致NADH/NAD+比率降低和细胞生长延迟。此外，单壁碳纳米管OH削弱了硝酸还原酶的活性。与原始单壁碳纳米管相比，单壁碳管OH对反硝化细菌的毒性可能更高，因为分散性增加，与大分子的结合潜力更好，与膜相互作用的机会更大。因此，观察到羟基官能化单壁碳纳米管的存在对反硝化产生负面影响，这将进一步干扰环境中的氮循环。


致谢


这项工作得到了国家自然科学基金（51425802、41301558、51472035和51202020）、上海学科首席科学家项目（15XD1503400）、江苏省科学技术厅（BY2013024-04和BE2014089）的资助。


附录A.补充数据


与本文相关的补充数据可在在线版本中找到，网址为：http://dx.doi.org/10.1016/j.cej.2015.05.005.