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摘要

杀菌剂百菌清（CHT）因其高效、杀菌等优点在茶园中得到广泛应用。据报道，反复施用CHT会抑制土壤硝化过程。然而，CHT对土壤反硝化和相关N2O排放的急性影响尚不清楚。本研究评估了硝酸盐（NO3−)72℃高温处理后茶园土壤的去除、反硝化基因丰度和反硝化酶活性。结果发现，将CHT从5 mg kg增加到25 mg kg−1抑制NO3−去除效率从74.6%提高到54.1%，但N2O排放量从23.1%增加到94.8%。用25 mg kg治疗后−在CHT中，nirK、nirS和nosZ基因的丰度分别降低了31.6%、22.1%和50.7%。另外，电子传递系统活性（ETSA）值和三磷酸腺苷（ATP）含量的下降表明CHT对微生物代谢有抑制作用。酶活性研究进一步表明，硝酸还原酶（NAR）、亚硝酸盐还原酶（NIR）和一氧化氮还原酶（NOR）活性的降低是CHT抑制反硝化作用的主要原因。此外，反硝化还原酶活性与细胞内代谢呈正相关，表明微生物代谢的减少也应是CHT对反硝化过程的抑制作用的原因。总的来说，研究发现，土壤急性暴露于CHT可抑制反硝化过程并显著增加N2O排放，这可能导致土壤氮循环破坏和全球变暖加剧。

1、引言

百菌清（CHT）由于其潜在的环境毒性，近几十年来备受关注。CHT作为一种广谱非系统杀菌剂，广泛用于控制小麦、水稻、蔬菜、花生、茶叶等作物的病虫害（张等，2014）。茶叶作为许多亚洲国家的重要经济作物，需要定期施用CHT来控制茶树病害（Gilho等人，2000）。CHT能牢固粘附在茶树表面，并能抵抗雨水和水的侵蚀。作为一种中等持久性农药，CHT在不同土壤中的半衰期（t1/2s）从三天到一个月不等（Hladik和Kuivila，2008；Singh等人，2002；Van Scoy和Tjeerdema，2014；Wu等人，2012）。由于其在农业中的广泛应用，在水、沉积物和土壤中发现了CHT及其代谢产物（Hladik和Kuivila，2008；Putnam等人，2003）。

氮循环是全球生物地球化学循环的重要组成部分，与富营养化、水体酸化和温室效应等一系列环境问题密切相关。作为氮循环的关键组成部分，反硝化可以减少硝酸盐（NO3−)从陆地和水生环境到氮（N2）。特别是，脱氮过程中可能会产生一氧化二氮（N2O），这是因为其具有巨大的全球变暖潜力（比二氧化碳（CO2）高300倍）（IPCC，2006年）。先前的研究表明，CHT应用抑制了土壤微生物活性（Sigler和Turco，2002），抑制了土壤硝化过程（Kinney等人，2005），并降低了土壤氮循环的功能基因丰度（Zhang等人，2016）。例如，Kinney等人（2005）进行的一项研究表明，由于土壤硝化作用对CHT的高度敏感性，在土壤中添加CHT会减少N2O的产生。张等（2016）报道，重复施用CHT可能会对几种氮循环基因的丰度产生显着的负面影响，例如amoA、amoB和nosZ基因。此外，CHT可以在不同类型的土壤中以较高的添加速率显着抑制硝化作用（Lang和Cai，2009）。尽管之前的研究已经表明CHT对硝化有负面影响，但CHT对反硝化的影响仍不确定。

脱氮需要从NO3开始一个连续的生物还原过程−至亚硝酸盐（NO2−),一氧化氮（NO）、N2O和N2。为了完成这一过程，反硝化需要接受来自其他生物过程的电子，例如碳源代谢和电子传输系统（Zumft，1997）。电子由碳源代谢产生，并传递到电子传输系统。然后，它们将在反硝化还原过程中被消耗，该过程由硝酸还原酶（NAR）、亚硝酸盐还原酶（NIR）、一氧化氮还原酶（NOR）和氧化亚氮还原酶（NOS）催化（Saggar等人，2013）。除了电子外，碳源代谢和电子传递链也可以产生ATP。作为细胞内能量转移的货币单位，其水平与脱氮密切相关（Knowles，1980）。遗憾的是，目前尚不清楚反硝化的综合分子机制，其涵盖了广泛的方法（即ETSA值、ATP含量和反硝化酶活性）。因此，土壤反硝化过程的全貌尚不清楚。

基于此，本研究旨在探讨CHT施用对土壤反硝化的急性影响及其相关分子机制。作为试验土壤，我们收集了中国江西省的茶园土壤。本研究的具体目标是：（1）研究NO3−不同CHT暴露浓度下的减少和N2O排放；（2）研究CHT施用后的反硝化还原酶活性、反硝化基因丰度和微生物群落；（3）评估CHT对电子传递链和微生物活性的急性影响；（4）了解反硝化过程与分子生物学指标之间的相关关系。考虑到之前关于CHT应用于土壤微生物活性的报道，我们假设：1）CHT应用可以抑制土壤反硝化过程；2）CHT通过影响反硝化酶活性来抑制反硝化；3）CHT施用后其他微生物活性的相关变化会影响土壤反硝化过程；ETSA值和ATP含量与反硝化酶活性密切相关。

2、材料和方法

2.1样品和化学品

2017年7月7日，从中国江西省江西红壤研究所（28°15′N，116°55′E）采集了5公斤茶园土壤样本（0-20厘米深）。土壤在室温下风干，通过2 mm筛网筛分以去除石块和塑料碎屑，在室温下储存，然后在10小时内进行实验。实验前，部分样品用于测定CHT残留物和土壤理化性质。所有样本均未检测到CHT或其代谢物的浓度。表S1显示了采样土壤的选定物理化学性质。CHT（98%活性成分）购自中国阿拉丁科技公司。CHT标准溶液购自中国J＆K Scientific。

2.2土壤急性暴露于CHT

土壤样本暴露于CHT浓度范围内（0、5、10和25 mg kg−1：分别为C0、C5、C10和C25），对应于推荐剂量（5 mg kg）−1），2倍剂量（10 mg kg−1）和5倍剂量（25 mg kg−1）（Teng等人，2017年）。简言之，将80 g干茶园土壤放置在血清瓶中，用含有相同浓度NO3的10 mL溶液处理每一种土壤−-N（110 mg kg−1）和葡萄糖（5 mg g−1).溶解CHT配方并添加到土壤样品中，以达到5、10和25 mg kg的目标浓度−1，并向一个瓶子中加入等量的蒸馏水作为对照。蒸馏水也被添加到每个瓶子中，以将最终土壤含水量保持在持水量的60%，这与土壤的原始状态相似。为了维持厌氧条件，将氮气注入蒸馏水中（30分钟，30–40毫升/分钟），以保持其最终氧化还原电位（ORP）=−300 mV和溶解氧（DO）分别为0.1 mg/L。用橡胶塞密封后，将含有土壤的血清瓶在28±1°C的恒温下培养72小时，以测定NO3−,NO2号−将相当于2 g干土的铵（NH4+）与20 mL 2 M KCL混合，并在200 rpm下摇晃30分钟（Miller等人，2008）。离心土壤溶液（4000 rpm，10分钟），并通过0.45μm孔径过滤器过滤悬浮液。然后，使用离子色谱ICS-600（美国Thermo Fisher Scientific）分析滤液。为了测定最终的N2O浓度，在培养结束时，用气密注射器抽取每个瓶子的10毫升顶空样品。使用配备电子捕获检测器的气相色谱法（2010 plus，日本岛津）分析气体样本（刘等人，2018）。根据测定的NO3−,NO2号−,土壤提取物中的NH4+和N2O浓度，NO3−,NO2号−,NH4+和N2O浓度转换为mg N kg−1土壤。如Chaves等人（2008）所述，使用气相色谱-质谱法（TQ8040，日本岛津）测定CHT残留物。支持信息中描述了细节提取和测量方法。

2.3反硝化酶活性的测定

本研究使用Zheng等人（2014b）报告的方法检测了四种反硝化酶（NAR、NIR、NOR和NOS）的活性。简言之，在72小时暴露后，使用磷酸盐缓冲盐缓冲液从5 g土壤样品中提取反硝化酶，冲洗两次，然后再悬浮在10 mL 0.1 M磷酸盐缓冲盐（PBS）溶液中，进行超声处理（4°C，200 W）和离心处理（16000 rpm，10分钟，4°C）。然后，将2 mL酶提取物添加到4 mL混合物中，该混合物根据先前报告的方法进行了修改（Zheng等人，2014b）。酶测定混合物（总体积4.0 mL）包括：100 mM PBS缓冲液、10 mM Na2S2O4和10 mM甲基紫精作为电子供体，以及2 mM电子受体（NO3）−和NO2−或NO和N2O）。培养30分钟（保持在30°C）后，NO3−和NO2−通过分光光度法测量浓度（DR 5000，HACH，美国），并通过微传感器（MMMMmeter，Unisense，Denmark）检测液相中的N2O浓度（Zheng等人，2014a）。NAR和NIR活性计算为μmol NO2-N·g−1土壤·h−1，NOR和NOS活性计算为μmol N2O-N·g−1土壤·h−1.

2.4.ETSA和ATP的测定

在本研究中，通过将2-（新苯基）-3-（对硝基苯基）-5-苯基四氮唑氯化物（INT）还原为甲赞（INF）来测量土壤中细菌的ETSA值（Broberg，1985；Wan等人，2016）。简而言之，在不同CHT浓度（C0、C5、C10和C25）下培养72小时后，在类似于酶提取过程的过程中收获细菌。然后，向收获的溶液中添加1 mL INT和1 mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），并在黑暗中（30°C，30分钟，200 rpm）培养。为了终止反应，向混合物中添加1 mL甲醛。在4000 rpm下离心10分钟后，使用5 mL薄荷醇从混合物（200 rpm，20分钟）中提取INF，然后在10000 rpm下离心5分钟。最后，在490 nm处用分光光度法检测INF提取物，并根据吸光度（ABS）值计算ETSA，即μgO2·mg−1蛋白质·min−1（Wan等人，2016年）。

用磷酸氢二钠（Na2HPO4）、三氯乙酸（TCA）和百草枯（TPP）提取5 g潮湿土壤样品。提取后立即进行超声波处理（4°C，2分钟，200 W）（Martens，2001）。在离心土壤样品（4°C，20分钟，13000 rpm）后，提取悬浮液并将其储存在0°C的塑料瓶中，并使用ATP测试试剂盒（中国江苏南京建诚科技有限公司）测量ATP浓度。ATP含量也根据ABS值计算为nmol g−1.

2.5 DNA提取和实时定量PCR分析

根据制造商的说明，使用土壤快速DNA®旋转试剂盒从对照处理和C25 CHT改良处理的5 g土壤样本中提取土壤DNA。使用NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计（美国Thermo Scientifisher）测定最终DNA浓度和纯化，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量。进行实时定量PCR分析以评估细菌16S rRNA总量和反硝化过程中功能基因的丰度，包括硝酸盐还原（narG）、亚硝酸盐还原（nirK和nirS）、一氧化氮还原（norB）和氧化亚氮还原（nosZ）（表S2）（Saggar等人，2013）。所有样品一式三份。功能基因的扩增效率为85-109%，R2值为0.990-0.998。

2.6高通量16S rRNA基因测序和分析

根据标准方案对16S rRNA基因进行高通量Illumina MiSeq测序（Caporaso等人，2012年）。原始fastq文件被解复用，通过Trimmomatic进行质量过滤，并通过短读取（FLASH）软件的快速长度调整进行合并。通过核糖体数据库项目（RDP）分类器算法对照16S rRNA数据库分析每个16S rRNA基因序列的分类(http://rdp.cme.msu.edu/)使用80%的置信阈值。

2.7统计方法

所有实验参数一式三份，数据以平均值±标准差表示。使用单向方差分析（ANOVA）和Tukey t检验比较C0、C5、C10和C25处理之间的差异。使用SPSS 19.0版软件进行数据分析。统计数据在P b 0.05时被认为存在显着差异。

3、结果和讨论

3.1 CHT在土壤中的残留

如图1所示，在72小时后测量不同改良处理中的CHT残留浓度。CHT残留浓度分别为3.8±3.3、7.7±1.8和22.8±1.4 mg kg−C5、C10和C25处理中分别为1。方差分析显示，C25处理的CHT浓度在统计学上显着高于C5（P b 0.01）和C10（P b 0.01）。C10处理的CHT浓度也显着高于C5处理（P＜0.05）。本研究中测得的CHT浓度高于Souza等人（2017）报告的结果，这可能是由于初始土壤应用中的浓度较高。或者，低耗散率也可能导致CHT累积。不同研究中CHT的土壤降解速率差异很大（Singh等人，2002年；Souza等人，2017年）。先前的研究表明，CHT降解与土壤条件密切相关（Van Scoy和Tjeerdema，2014），中性pH值和3-4%的总碳含量等土壤特性有利于CHT的高效降解（王等人，2011）。在本研究中，茶园土壤的低pH值可能是CHT在土壤中低效降解和高积累的原因。

图1.三种浓度的百菌清（CHT）（5、10和25 mg kg）的残留−1）施用后72小时在土壤中。误差条表示三次测试的标准偏差。A*以上数据表明对照组和CHT处理之间存在显着差异（P b 0.05）。

3.2 CHT对土壤反硝化过程的影响

为了比较对照处理和CHT应用处理中的反硝化过程，研究了NO3的变化−和NO2−本研究确定了72小时试验期间的浓度以及最终N2O浓度。

图2百菌清（CHT）对NO3变化的影响−（a），最终编号2−反硝化过程中的浓度（b）和最终N2O生成（c）。误差条表示三次测试的标准偏差。Tukey t检验，与对照组相比，*P b 0.05，**P b 0.01。

如图2a所示，NO3的最终浓度−在测试的四种处理中，范围为18.5至54.2 mg N kg−1、与C5、C10和C25处理相比，NO3的83.8%−在对照治疗（C0）中被移除。3号−C25处理的去除率显着下降至54.1%（P＜0.01）。NO2的变化−72小时内的浓度如图S1所示，最终NO2−四种处理的浓度不同（C25≈C10≫C5 N C0），范围为3.5 mg N kg−1（C0）至5.3 mg N kg−1（C25）。考虑到接触CHT的潜在毒性，较高的NO2−C10（P b 0.01）和C25（P b 0.01）处理中的累积可能是由于CHT对NO3的负面影响−和NO2−还原过程。此前的一项研究也报告了不同杀菌剂（如2-氯-4-苯基苯酚和2-苄基-4-氯酚）对反硝化过程的类似抑制作用（Holzem等人，2014）。结果表明，随着杀菌剂浓度的增加，反硝化抑制作用增强。然而，郎和蔡（2009）观察到CHT和多菌灵对反硝化的不同现象。据报道，这两种杀菌剂在田间添加速率下对反硝化没有影响，而CHT在浓度为110或220 mg kg时对土壤反硝化略有抑制−1.杀菌剂对土壤反硝化作用的不同影响可能与杀菌剂类型、添加量、培养条件和土壤微生物群落有关。如图2c所示，对照组中的最终N2O浓度（39μg N kg−1）显着低于C25处理（76μg N kg）−1）（P b 0.01），比对照组高1倍。这一结果与之前的研究一致，之前的研究报告称，施用杀菌剂后，N2O排放和积累增加（Yan等人，2015年）。在本研究中，实验期间土壤NH4+浓度没有明显变化（图S2），表明没有发生实质性的硝化作用，几乎所有的N2O都是通过反硝化作用产生的。Kinney等人（2005）报告说，增加CHT施用量会抑制反硝化过程中的N2O生成。这表明CHT可能抑制NO到N2O的还原过程，并减少N2O的生成。基于这些数据，本研究中C25处理的最终N2O浓度较高可能是由于对N2O消耗过程的抑制作用强于对N2O生产过程的抑制作用。对于N2O的排放，N2O消耗过程（N2O→N2）似乎比其生产过程更重要（否→N2O）（Van den Heuvel等人，2011年）。鉴于此，本研究测定了四种反硝化酶的活性，以评估CHT对反硝化过程每个步骤的影响。