全球领先的微电极研究系统

概要

•水生植物的水下光合作用通常受到CO2可用性低的限制，光呼吸可能很高。一些水生植物利用景天酸代谢（CAM）光合作用。评估了CAM对增加水下光合作用和抑制光呼吸的益处，水韭是一种生活在浅临时岩石池中的沉水植物。

•在CO2和O2浓度范围内，评估苹果酸含量高或低的叶片的水下净光合作用和表观光呼吸。

•与黄昏相比，黎明时叶片苹果酸含量高出9.7倍，并且叶片可滴定酸度（1mol H+当量）的变化也表明了CAM活性。苹果酸含量高的叶片在较低的外部CO2浓度下不仅表现出较高的水下净光合作用，而且表现出较低的表观光呼吸。在O2浓度范围内，包括低于空气平衡的值，CAM对表观光呼吸的抑制很明显。在2.2倍于大气平衡浓度的高O2浓度下，净光合作用显着减少，尽管在苹果酸浓度高的叶片中保持正光合作用，但在苹果酸浓度低的叶片中变为负光合作用。

•水生植物中的CAM通过增加CO2固定和抑制光呼吸，在洪水中的大O2和CO2浓度范围内实现更高的水下净光合作用速率。

介绍

沉水水生植物表现出一系列促进无机碳吸收的适应性，因为与空气相比，水中气体扩散缓慢，大大阻碍了水下光合作用的碳获取。形态适应包括丝状叶，以减少扩散边界层的厚度，以及薄或缺失的角质层，以降低从水中吸收二氧化碳的阻力（Maberly和Madsen，2002）。此外，一些植物可以利用替代的CO2源；例如，浮叶直接接触大气CO2，而大渗透根系接触沉积物CO2（Maberly&Madsen，2002）。应对洪水中低CO2可用性的生理适应包括在Rubisco增加CO2，通常称为碳浓缩机制（CCMs）（Maberly&Madsen，2002；Raven等人，2008）；这些是碳酸氢盐使用（Prins和Elzenga，1989）、C4光合作用（Magnin等人，1997）、C3-C4中间体（Keeley，1999）和景天蓝酸代谢（CAM）光合作用（Keeley，1981；Madsen，1985；Raven等人，1988）。

除了增强水下光合作用外，CCMs还可能减少沉水水生植物的光呼吸（Maberly和Madsen，2002）。光呼吸源于Rubisco的加氧酶活性，并由低CO2:O2比率促进（Ogren，1984；Sage，2004）。水生环境中的低CO2可用性本身降低了CO2:O2比率；此外，由于O2在水中的可溶性比CO2低28.5倍（Baranenko等人，1990年），O2往往在白天在光合组织的气体空间内积聚，因为向周围溶液的逃逸可能很慢（Bowes，1993年）。因此，使用CAM等CCMs，可以在Rubisco维持更有利的CO2:O2比，从而减少光呼吸。与缺乏CCMs的物种相比，具有CCMs的水生植物光呼吸减少的推断基于较低的CO2补偿点（Salvucci&Bowes，1983；Madsen，1987）；缺乏对具有CAM的水生植物光呼吸的直接评估。

水生植物中的CAM（Keeley，1998a）与陆生植物中的CAM（Lu–ttge，2002）一样，涉及夜间将CO2固定到苹果酸中，然后在白天将苹果酸脱羧，从而将CO2供应到C3途径，而不需要外部CO2同时向内扩散。水生植物中的钙调素首次被报道用于howellii水韭（Keeley，1981），随后被证明出现在大多数水韭物种中，以及在厚壳水韭属、Eleocharis属、Littorella属、慈姑属和Scirpus属的一些物种中（Keeley，1998a）。CAM活性由苹果酸浓度的大日波动表示，通常测量为组织提取物可滴定酸度的变化（Keeley，1998a）。在水韭物种中，夜间固定的CO2可能占固定无机碳的50%，但物种内部和物种之间存在巨大差异（Keeley，1983a，1985）。当水分消退时，大多数水韭物种形成缺乏CAM的“气生叶”并形成气孔（Keeley等人，1983a，b），强调CAM在沉水水生植物中作为CCM的作用。

CAM光合作用在同工酶中尤其频繁（Raven等人，1988年；Keeley，1998a）。水韭是一种水生植物，叶子短而硬，呈莲座状排列（Hutchinson，1975），通常具有厚表皮；当被淹没时，它们缺乏气孔，并且具有大的腔隙，为气体扩散提供了低阻力的途径。根通常不分枝，占植物总质量的50%或更多（Hutchinson，1975）。水韭通常栖息在无机碳含量低的寡营养软水湖（Smolders等人，2002年），因此利用沉积物CO2池的能力尤其有利（Maberly和Madsen，2002年）。水韭还可能占据高海拔湿地（主要是水韭属；Keeley，1998a）或季节性湿地，如沙丘（Littorella uniflora；Pedersen等人，2006）和临时池（雨水补给的岩石池；水韭属；Keeley，1998a）。在这些植物生物量高、水量相对较低的栖息地中，溶解CO2的日变化较大，CAM是最常见的CCM（Keeley&Rundel，2003；Raven等人，2008）。

本研究使用CAM同工酶物种澳大利亚水韭（Keeley，1983b）检验了两个假设。首先，与苹果酸含量低的叶片相比，苹果酸含量高的叶片表现出增强的水下净光合作用，尤其是在低外部CO2浓度下。其次，基于低CO2补偿点（Salvucci&Bowes，1983；Maberly&Madsen，2002），在实验中测试了CAM降低光呼吸的长期假设，在实验中测量了水下净光合作用和表观光呼吸，同时操纵了外部CO2和O2浓度。数据表明，在较低的外部CO2浓度下，苹果酸含量高的组织增强了水下净光合作用，而CAM也减少了明显的光呼吸。

材料和方法

植物材料

2009年10月，从西澳大利亚珀斯以东约400公里的临时浅花岗岩岩池（图1；118.2896E，30.7468S）收集了澳大利亚水韭的完整草皮（20厘米宽，2厘米深；该深度对池中几乎所有的浅层沉积物进行了采样）。草坪在4.5升白色塑料容器中暴露在塑料下的空气中运输到珀斯的人工气候室（夜间15℃，白天20℃）。

图1澳大利亚西南部的临时花岗岩岩池（a）和典型的水下植被（b）。临时岩石池每年冬天都会有雨水供应，持续3-5个月。水浅（5–10 cm），电导率低（<10–80 lS cm）1）；沉积物由风化花岗岩组成，有机质含量低（2.3±0.6%DW；n=5），深度通常小于2 cm。然而，密集的水韭种群通常会发育（b），并且可以与其他植物（舌苔属、厚壳水韭、Marselia和Eleocharis）共存，这是临时花岗岩岩池的典型特征（Tuckett等人，2010）。巴，5厘米。

大多数实验使用的是沉水培养的植物，在“人工洪水”（定义见下文）表面以下3-5厘米处，蒸发后注入去离子水。在一个实验中，将之前完全浸没的植物去浸没，并将其在浸水的沉积物中保持6周，枝条在空气中。将在空气中形成的叶子与连续浸水处理的植物进行比较。人工洪水是一种最终电导率为85 lS cm）1的溶液，由去离子水（单位：mol m）3组成：0.15 Ca2+、0.10 Mg2+、0.10 K+、0.30 Cl）、0.10 SO42）和0.10 HCO3）。该低EC溶液旨在模拟采集样本的临时岩石池中的水。在人工气候室中，I.australis继续生长，叶片周转率约为1叶wk）1。每周移去舌苔属和厚壳属的幼苗，以维持澳大利亚鸢尾的单作。采集草坪后，使用叶组织长达6周。

水下净光合作用–CO2响应

使用Colmer&Pedersen（2008）中描述的方法测量了叶片的水下净光合作用。切除无无色素白色基部的叶尖（5-10毫米）（以下简称“叶子”），并将其放置在带有塞子的玻璃瓶中（10毫升）。每个小瓶在培养基中含有两片叶子，以及两个玻璃珠，当小瓶在照明水浴（20C）内的轮子上旋转时用于混合。浸没玻璃瓶内的光合有效辐射（标准杆数）为350 lmol m）2 s）1（使用4p US-SQS⁄L测量；Walz，Effeltrich，Germany）。

培养基的成分与人工洪水（如前一节所述）相同，但KHCO3的含量不同（本段将进一步描述），溶液中还含有2.5 mol m的2-（N-吗啉基）乙磺酸（MES）3，pH值使用KOH调节至6.00。通过在1:1 v/v的N2和空气中鼓泡（在调节溶解CO2之前），将培养基中的溶解O2浓度设置为空气平衡的50%；这避免了测量过程中高O2的积聚。由于小瓶在加入叶子后立即在光下孵化，并且在光下产生O2，因此没有组织缺氧的风险。通过向培养基中添加特定浓度的KHCO3，并根据添加的KHCO3使用不同量的KOH将pH值始终调整为6.00，施加溶解CO2处理，以提供30至2000 mmol m）3的CO2浓度范围（Stumm&Morgan，1996）。在各种处理中根据需要添加硫酸钾，以使各处理的钾离子浓度相等。对于每种CO2浓度，没有叶子的小瓶作为空白。

在已知持续时间（60–75分钟）的培养后，使用连接到皮安计（PA2000；Unisense a⁄S）的克拉克型O2微电极（Revsbech，1989；OX-25；Unisense a⁄S，丹麦奥胡斯）测量小瓶中的溶解O2浓度。使用前立即校准电极。

使用叶面积计（Li-3000；Li Cor，Lincoln，NE，USA）测量叶样品的投影面积。投影面积使用根据叶片直径和圆柱形叶片和锥形尖端的长度测量面积所得的经验关系转换为实际表面积。实际面积与投影面积之比为3.633（n=10）。还测定了叶片样品的新鲜和干燥质量（冷冻干燥后）。实际叶面积与干物质之比为17.54 g m）2（n=4）。

水下净光合作用–O2响应

使用与已描述的CO2响应相同的系统测量叶片的水下净光合作用；然而，初始O2浓度被控制，而不是CO2。初始O2浓度通过使容器中充满N2或O2，然后根据需要将其混合来调整，以获得所需的O2浓度。混合后，将KHCO3注入所有小瓶的培养基中，以在pH 6.00下获得30 mmol CO2 m）3。与光合作用相关的表观光呼吸增加明显表现为净O2产生速率下降，低于O2最佳时的最大速率。在一些样本（即苹果酸含量低的组织）中，由于光呼吸超过光合作用，出现了净O2消耗（即光合作用产生的O2低于O2消耗）为了进行比较，还测量了“暗呼吸”（见下文）。图5显示了培养期间小瓶中的平均O2浓度的净光合作用速率，如用O2微电极测量的。

水下暗呼吸（Rd）

在黑暗条件下，使用与之前描述的CO2响应相同的系统，但在熄灯的情况下，测量了叶片在水下的呼吸。通过将容器与N2或O2一起鼓泡，然后根据需要将其混合，以获得半空气平衡、空气平衡和双空气平衡的所需O2浓度，来调整介质的初始O2浓度。混合后，注入KHCO3以在pH 6.00下获得30 mmol CO2 m）3。使用四个叶尖，而不是水下净光合作用实验中使用的两个叶尖，以将培养时间保持在约2小时。在黑暗中测量小瓶中的净O2摄取量，并记录组织的投影面积和干质量。

组织有机酸

黎明或黄昏时采集的叶片在液氮中冷冻，冷冻干燥，在球磨机中研磨，然后在冰凉的5%（v/v）高氯酸中提取（Fan等人，1993）。使用旋涡混合提取物，在12096 g下离心30分钟，并收集上清液。在5%（v⁄v）高氯酸中第二次提取颗粒。使用K2CO3将两种提取物的组合上清液的pH值调整为3.0–3.5，以沉淀高氯酸盐。再次离心样品，收集上清液，并测量体积。在高效液相色谱（HPLC）分析之前过滤提取物（0.22 lm）。

通过稍微调整Cawthray（2003）描述的方法，通过HPLC（600E泵，717plus自动注射器，996光电二极管阵列检测器；Waters，Milford，MA，USA）分析组织提取物中的有机酸。简言之，在22±0.5C的条件下，使用由25 mm KH2PO4组成的流动相，在pH 2.50和1 ml min下，在Preval C-18色谱柱（内径250·4.6 mm，5-lm填料；Alltech Associates，Deerfield，IL，USA）1上实现分离。每五个样品使用60%甲醇的梯度洗脱程序来冲洗更疏水的化合物柱，并消除夹带物。检测和定量在210 nm处进行，光电二极管阵列（PDA）采集在195至400 nm之间，通过比较保留时间和PDA峰光谱分析（包括峰纯度）标准品与未知物的峰纯度，对有机酸进行阳性识别。根据峰面积与注入的标准有机酸质量的关系，生成每种有机酸的校准曲线。使用EMPOWER色谱软件（Waters）进行数据采集和处理。有机酸标准品（包括苹果酸、异柠檬酸、丙二酸、莽草酸、乳酸、乙酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、顺乌头酸和反乌头酸）的保留时间和PDA光谱数据用于识别组织提取物中的有机酸。在HPLC之前，样品的pH值<4.0，典型的样品注射量范围为20到100微升。在提取之前，将苹果酸和柠檬酸添加到一些额外的澳洲一品红叶片样品中，验证了该方法；苹果酸和柠檬酸的回收率分别为101±6和98±6（平均值±SE；n=4）。提供的数据未经调整。

可滴定组织酸度

可滴定组织酸度的日变化（即组织匀浆的滴定）已被用作衡量夜间二氧化碳固定产生苹果酸和白天苹果酸脱羧引起的苹果酸日变化的指标（Lu–ttge，2004）。因此，除了组织有机酸外，我们还测量了可滴定的组织酸度，以便于与以前对水韭属植物中CAM活性的研究进行比较。

在黎明或黄昏取样的叶片立即冷冻（）18C），并在取样后1小时内进行分析。使用冰上的研钵和研杵使冷冻组织均质，并在添加无二氧化碳去离子水（0.1 g组织FW在5 ml水中）后，将混合物转移到玻璃瓶中，并按照Keeley&Sandquist（1991）的程序用0.01 N NaOH滴定至pH 6.40。