生物获取营养首先需要识别并传感到营养才可能根据自身对营养的需求情况吸收相应的营养。植物要平衡、调节其体内的营养，必须建立有效的传感系统，用来迅速传感各个营养素在根际土壤中是否存在及其浓度的信息，以应对土壤中可利用的养分在时间和空间上的剧烈波动。氮是植物生长最重要的元素，尿素CO(NH2)2是全球最常用的氮肥。尿素不仅相对含氮量高，而且是植物体内精氨酸循环的重要中间代谢产物，对植物体内的氮素循环和碳氮平衡起到重要作用。


高等植物对无机氮(铵态氮、硝态氮)和有机氮的传感吸收能力各有不同，现有的研究表明，大多数植物都存在对不同种类氮源的低亲和力和高亲和力2种传感转运系统。迄今为止，对于氮源传感和吸收的研究主要集中在植物体内硝酸根离子转运系统和铵根离子转运系统，但对尿素传感、吸收和转运系统的鉴定和相关功能的研究还停留在尿素也可以作为植物快速吸收利用的氮源阶段。虽然已发现了2类转运尿素的膜蛋白，即MIPs和DUR3，它们分别在低亲和力、高亲和力尿素吸收和运输中发挥作用，但是其确切的传感受体和机制仍需进一步的研究。


尿素的大量施用虽有助于农作物提高产量，但是由于植物对氮的利用效率并不清楚，这种做法会因为氮营养过剩而严重危害环境。寻找适合植物的最佳施肥量，需要深入了解不同植物根系传感和吸收营养的动力学规律。植物根系对养分的传感能力始终受到科学家的关注，现有的研究方法多为通过同位素标记检测其相关的吸收动力学或是异源表达相关基因验证其效果，但根系对营养的传感能力应远高于其吸收能力，而生物必须先传感到营养才可以进一步吸收利用。本课题组经过多年研究，已经成功构建了动物受体传感器和动物组织传感器，并进行了相关物质的传感动力学研究。目前在植物组织或植物受体传感器的研究方面尚未见报道，如果能够成功构建植物根分生组织和受体传感器，并对相应的营养物配体进行传感动力学研究，一方面有助于解决当下过度施肥引起的土壤板结和水环境污染;另一方面有助于进一步采用生物技术方法提高植物氮素利用效率。该传感器的成功构建可为植物根系营养传感及其吸收和调节机制研究、农业精准施肥提供一种新的研究方法。


本研究选择玉米、辣椒、花椰菜和黄瓜4种植物的根尖分生组织组装传感器，定量化测定传感配体——尿素。通过电化学工作站和时间—电流曲线法测定尿素与玉米、辣椒、花椰菜和黄瓜根尖分生组织相互作用所产生的配体—受体识别和联动变构所产生的电化学信号，得到4种植物根尖对尿素的传感范围和相应的动力学参数，并通过相应的培养实验验证其真实的生物学作用。


1材料与方法


1.1材料与试剂


玉米(Zea mays L.)、辣椒(Capsicum annuumL.苗、花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis L.)、黄瓜(Cucumissativus L.)苗各10株。可溶性淀粉、无水CaCl2、尿素等均购自天津市赢达稀贵化学试剂厂(中国)。海藻酸钠来自天津光复精细化工研究所(中国)。所有其他化学品均为分析纯。去离子水来自Millipore公司的Milli-Q纯水系统(Elix Essential 5，美国)，并被用在所有的实验中。


CHI660E型电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司(中国上海);核微孔膜(孔径0.22μm，周长25 mm)购自Whatman公司(英国)。


1.2电极预处理与效果表征


将玻碳电极(glassy carbon electrode，GCE)用不同粒径的α-Al2O3浆(1.00、0.30、0.05μm)在麂皮上抛光，每次抛光后在超声波水浴中清洗30 s，重复2~3次，然后用超纯水清洗玻碳电极。在1 mol·L-1 H2SO4溶液中使用循环伏安法对玻碳电极进行活化，活化时电压的扫描范围是-1.0~1.0 V、扫描速率是100 mV·s-1，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线图。


将活化的玻碳电极置于1×10-3 mol·L-1 K3Fe(CN)6溶液(含0.20mol·L-1 KNO3)中对其进行循环伏安曲线扫描，电压的扫描范围为-0.1~0.6 V，扫描速度为50 mV·s-1。同时，使用交流阻抗法表征电子传递到电极表面所受到的阻抗大小，以达到间接表征电极预处理后的界面情况。最后置于氮气环境中干燥待用。


1.3电化学生物传感器的制备


溶液配置:①1%的可溶性淀粉溶液:称取1 g可溶性淀粉溶于99 mL超纯水中，之后加入1 mL 10%的戊二醛，80℃水浴搅拌加热30 min。室温条件下放置过夜。②2%的海藻酸钠溶液:称取2 g海藻酸钠溶于100 mL超纯水中，搅拌过夜。③5%的CaCl2溶液:称取5 g CaCl2溶于100 mL超纯水中。④将1%的可溶性淀粉溶液与2%的海藻酸钠溶液以体积比1:1混匀在平皿中，另取一平皿吸取等体积的5%的CaCl2溶液。


固定化植物组织传感器组装:将新鲜的根尖分生组织用超纯水清洗干净，在细胞培养皿中用手术刀切碎，过程中保持根尖湿润，立即储藏在4℃冰箱中备用。


将准备好的0.25 cm2的植物根尖分生组织放置于一张直径为25 mm、孔径为0.22μm的核微孔膜的圆心上，然后覆盖另一张，迅速将1号培养皿中的混合液均匀涂抹在核微孔膜边缘，再将其边缘浸没在2号培养皿中，使得海藻酸钠与CaCl2完全交联，得到稳定的螯合物，然后用超纯水冲洗组装好的植物根尖分生组织测定膜，冲洗掉残留在膜上的Cl-、Ca2+等离子，最后将组装好的植物根尖分生组织测定膜用皮筋固定在玻碳电极上，植物根尖分生组织要完全覆盖电极极芯，再用超纯水冲淋电极制成生物传感器(图1)。

图1植物根尖分生组织传感器测定原理图


1.4电化学生物传感器对植物根尖分生组织的测定方法


采用三电极系统，以固定好的“三明治”式植物根尖分生组织膜的玻碳电极作为工作电极，以Ag/AgCl电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，以超纯水作空白对照，在一定的电压下通过电流—时间测定法测定尿素溶液与植物根尖分生组织作用的响应电流值，以响应电流的变化率作为检测指标，每个浓度平行测定3次。按公式(1)计算响应电流的变化率ΔI。

式(1)中:I1表示空白对照的响应电流值/A，I2表示待测定尿素溶液的响应电流值/A。