房颤(atrial fibrillation，AF)是临床最常见的心律失常之一，研究者认为心房重塑的早期改变，主要是心房电重构。心脏组织片电活动较单个心肌细胞更接近生理状态，本实验通过对微电极阵列芯片(microelectrode arrays chip，MEA)技术对AF犬心耳组织片60个位点同步、动态记录并通过整体组织片水平记录AF犬心房组织的电生理变化，探索其基本的电生理特性。


1材料和方法


1.1实验动物和分组


随意来源犬12只，体重(18±2.64)kg，年龄1～1.5岁，雌雄不限，由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心提供【SCXK(新)2010-0001】。分为48 h AF组(n=6)和对照组(n=6)。本实验的设计及实施均通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准审核，符合中国动物实验的福利伦理准则，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀(审批号:A-20100310013)。


1.2主要实验设备和溶液


Aaeon7200A呼吸麻醉机(北京谊安医疗系统股份有限公司);LEAD-2000电生理仪(四川锦江电子科技，中国);DF-4A型心脏电生理刺激仪(苏州中国东方电子仪器厂，中国);微电极阵列芯片系统(MEA，德国)，MEA1060放大器，刺激仪，温控仪。


正常台氏液组成:NaCL 140 mmol/L、KCL 4 mmol/L、MgCl2l mmol/L、CaCl2l mmol/L、Hepes l0 mmol/L、葡萄糖1 g，NaOH滴定将pH值校至7.36，采用超纯水配制。实验前37℃孵育，使用前1 h充100%氧饱和。


1.3快速心房起搏AF模型的建立


随意来源犬术前12 h禁食，6 h禁饮。肌注氯胺酮(20 mg/kg)基础麻醉后以3%的戊巴比妥钠(20 mg/kg)静脉注射维持麻醉。气管插管，必要时呼吸机辅助呼吸，调节氧流量4～6 L/min，潮气量为10 mL/kg，呼吸压力0～2 kPa。连接lead-2000电生理仪，以II导联作为监护导联，肝素化(300 U/kg)。股动脉接入压力换能器连于监护仪记录血流动力学变化。造模过程中持续监测体温、心率、心律、血压、血氧饱和度、血电解质等指标，并根据监测结果予以输液、吸氧、补钾、抗感染等支持。


由股静脉置入2极电极导管至右心室记录心内电生理图，供紧急起搏用，当监视仪上显示为大V波无A波时，表示置管成功。由右侧颈外静脉置入4极电极导管于右心房，当心内电图记录为大A波无V波时，置管成功。以周长100 ms行S1S1刺激，2倍的阈值刺激电压刺激右心房，1～5 min后AF图形出现，持续起搏48 h。对照组只置入电极48 h不行心房起搏。


实验过程中，未有恶性心律失常发生、未有心力衰竭、一只犬AF36 h后因肺栓塞死亡，后又补充一只AF犬，共有12只犬完成实验，标注造模的成功率为91.6%。


1.4心脏标本的制备及固定


犬快速起搏48 h后，迅速开胸取心，分别切取约5～8 mm2大小全层左心耳(left atrial appendage，LAA)、右心耳(right atrial appendage，RAA)，置于4℃充氧改良台式液中。用银丝制成O形框架，将尼龙丝粘附在O型框架上制成盖网，并用盖网将组织标本固定于MEA电极上。


1.5微电极阵列系统记录LAA和RAA场电位


分别将LAA、RAA置于MEA-1060-AMP的MEA芯片(图1，彩插5)，由TCO2温控仪调整温度在37℃。将电极芯片中注入2 mL改良台式液灌流LAA、RAA，与TCO2温控仪、数据采集系统等相连接。标本置入电极前，放大器和温控仪先预热30 min，待标本放入且信号稳定后开始记录LAA及RAA组织场电位(field action potential，FAP)。


从MEA电极芯片60个通道同步获取的心电信号通过MEA-1060-AMP放大(单端放大，每个通道均为双极记录，两电极间的距离为700μm，直径100μm。带宽10～3400 Hz;放大倍数为1200倍;输入阻抗大于1010Ω，输出阻抗330Ω)，通过MC-Rack 4.01软件对心电活动信号采样。采样信息实时显示于工作站显示屏，可储存于计算机，以备在线或离线分析(图2，彩插5)。


1.6 MEA场电位检测指标


场电位的分析有如下参数:FPmin是场电位的第一个负向峰值，即最小场电位;FPmax是场电位最后一个正向波峰值，即最大场电位;FPdur为FPmin和FPmax之间的间期。可见场电位类似与细胞的动作电位，其场电位时程和动作电位及心电图的QT间期相对应，因此能反映细胞的除极和复极时间(图3，彩插5)。

图1微电极阵芯片标测系统

图2实验流程图

图3场电位形态及FP的测量和检测指标


1.7 MEA记录两组犬LAA，RAA组织块电激动传导顺序


在心耳组织片同一记录平面，各微电极接触心耳组织所记录场电位信号的电压和时间差异，信号电压最大窗口和最早出现的窗口一般为最早激动和激动起源点处，利用MC-Rack分析软件，根据peakpeak amplitude的变化可绘制出场电位激动顺序图。可见从黑色到红色到黄色到白色，代表0～400μV，电压越大颜色越趋向于白色，代表激动越早，电压越小，越向于黑色，代表激动越晚。



微电极阵列应用于心脏的传导异常相关的心律失常的机制研究（一）

微电极阵列应用于心脏的传导异常相关的心律失常的机制研究（二）