研究简介:口臭是牙周病的一种特征性症状，由硫酸盐还原菌产生的挥发性硫化物(VSCs)引起，如硫化氢(H2S)和甲硫醇。重要的是在体外系统中，可培养的主要牙周机会性病原体牙龈卟啉单胞菌(Pg)、核酸棒状杆菌(Fn)和连翘炭疽杆菌(Tf)通过气相色谱法测量都会产生H2S。H2S不仅可以由细菌产生，也可以由宿主的代谢系统产生。然而，牙周细菌产生的H2S是否会影响牙周细菌周围溶液中的H2S浓度，这一点尚不明确。H2S与心血管和神经系统的调节以及炎症有关。它通过特定的酶（如CBS和CSE）自动产生，并可能与炎症反应有关。牙龈上皮细胞是牙龈缝隙的第一道防线，对宿主的先天性和适应性免疫反应至关重要。它们通过产生促炎细胞因子和抗菌肽来保护宿主免受细菌挑战。Pg和其他假定的牙周病原体不仅在病变的牙周袋中定植，也会在健康的牙龈缝隙中定植，但其对健康牙龈上皮细胞的影响尚未得到充分研究。研究推测牙周细菌产生的H2S可能通过上调牙龈上皮细胞产生的IL-8来促进炎症反应。本研究的目的是监测不同口腔细菌菌株释放的H2S浓度，并研究Pg释放的H2S对牙龈上皮细胞产生的促炎细胞因子IL-8的影响。


Unisense硫化氢微电极与氢电极应用


细菌在肉汤培养基中培养至对数生长后期，然后调节所有菌株的浓度至光密度(OD 590nm)为0.9。然后，将细菌悬浮液在7000rpm转速下离心15分钟。上清液立即用针式H2S或H2电极(UnisenseA/S，丹麦)测量硫化氢(H2S)或氢气(H2)。每次测试时，都要让传感器稳定下来，并以5秒钟的间隔取三个测试点。在肉汤中培养的每种细菌菌株至少要分别进行三次H2S和H2的生成检测。


实验结果


IL-8介导的主要生物功能是对中性粒细胞(一种清道夫细胞)的化学吸引。中性粒细胞会迁移到上皮细胞释放IL-8的部位，促进细菌的吞噬。一般来说，中性粒细胞释放的活性氧(ROS)不仅能杀死细菌，还能加剧炎症。H2S介导的上皮细胞IL-8上调应该会通过招募过多的中性粒细胞来增强该部位的炎症。体内研究表明，内源性H2S和外源性H2S都有助于增加中性粒细胞向胰腺、肺和肝脏炎症诱导区的迁移，这支持了我们的假设，即牙周细菌释放的H2S也能促进中性粒细胞向牙周袋的趋化。首次证明了红色复合牙周细菌Pg产生的H2S浓度能够上调牙龈和口腔上皮细胞中诱导的IL-8表达，揭示了可能促进牙周疾病炎症的机制。

图1、测量口腔细菌释放的H2S：在厌氧条件下培养属于不同致病菌群复合体的14种细菌，直到它们达到对数生长后期。所有菌株的浓度均调整至0.9(以OD 590nm测量)。使用针式H2S或H2传感器测量细菌培养液中的H2S和H2浓度。

图2、外源H2S对OBA9和OKF6细胞IL-8产量的影响：将汇合培养的牙龈上皮细胞系(OBA9)或口腔上皮细胞系(OKF6)暴露于连续稀释的H2S供体Na2S中24小时，无论是否有PMA(1µmolfL)刺激。用酶联免疫吸附法测定OBA9(A)或OKF6(B)产生的培养上清中IL-8的浓度。

图3、Pg W83释放的可溶性因子(包括H2S)对OBA9和OKF6产生IL-8的影响：图示为transwell检测系统(A)。将上皮细胞OBA9或OKF6培养在下腔中，直至其完全覆盖组织培养孔表面。随后，将活体或固定的Pg W83与或不与H2S清除剂一起放入上腔。它们在含有炎症刺激物PMA(1μmol/L)的KSF培养基中共同培养24小时。用酶联免疫吸附法测定OBA9(B,D)或OKF6(C,E)培养上清中IL-8的浓度。

图4、野生型Pg 33277或Pg KDP137(RGP-KGP-HagA三重缺失突变株)的对数生长期培养液使用针型H2S传感器检测H2S浓度。数据为三个培养物的平均值±SD。(B)OBA9细胞在下腔培养，Pg KDP137在有或没有吗啉树脂的PMA(1mmol/L)存在下应用于transwell共培养系统的上腔。共培养48小时后，用ELISA法测定培养上清液中IL-8的浓度。


结论与展望


硫化氢(H2S)是一种挥发性硫化合物，被认为是导致炎症的原因之一，尤其是由胃肠道器官中的细菌产生的硫化氢。然而，目前还不清楚牙周病原体产生的H2S是否会影响口腔/牙龈上皮细胞介导的炎症反应。因此本论文研究的目的是比较14株口腔细菌体外产生H2S的情况；评估H2S对宿主口腔/牙龈上皮细胞诱导的炎症反应的影响。Unisense微电极系统被用来精确测量口腔细菌在培养基中释放的硫化氢（H2S）浓度。这种微电极能够检测溶解在溶液中的小气体分子，包括H2S和氢气（H2）。评估了不同细菌菌株产生的硫化氢量，从而识别出产生硫化氢最多的菌株，例如牙龈卟啉单胞菌（Pg）。通过unisense微电极系统测量硫化氢的浓度，研究人员能够进一步研究硫化氢如何影响宿主细胞，特别是牙龈和口腔上皮细胞产生促炎细胞因子IL-8，从而揭示硫化氢在牙周病炎症中的作用。牙龈卟啉单胞菌(Pg)在培养过程中产生的H2S最多，这反过来又促进了牙龈和口腔上皮细胞产生促炎细胞因子IL-8。IL-8表达的上调在外源性H2S的作用下得以重现。此外不产生主要可溶性毒力因子(即龈肽酶)的Pg突变菌株仍会产生H2S，并促进上皮细胞IL-8的产生，而H2S清除试剂则会抑制这种作用。这些结果表明，Pg产生的H2S浓度能够上调牙龈和口腔上皮细胞中诱导的IL-8表达，揭示了可能促进牙周病炎症的机制。Unisense微电极系统癌本研中它为研究人员提供了一种精确、可靠的方法来测量和分析口腔细菌产生的硫化氢，这对于理解硫化氢在牙周病中的作用机制至关重要。