实验步骤

采样

除非另有说明，浆果是在2007年6月和7月、2010年和2011年从美国马萨诸塞州法尔茅斯的Little Sippewissett盐沼形成的单个潮间带池中采样的（北纬41°34′33.01′，西经70°38′21.24′））。2012年9月从Little Sippewissett(41°34'33.52'N,70°38'9.71'W)的第二个水池中采集了用于银线硫化物捕获和循环微伏安法的大浆果（直径约0.5-1厘米）.粉红色浆果也取自美国马萨诸塞州伍兹霍尔的彭赞斯角沼泽(41°31′29.95′N,70°41′7.48′W)，并于2011年夏季采集。浆果是从沉积物中收集的——通过筛分（1 mm网孔大小）去除水界面，并在0.2μM过滤除菌的沼泽水中洗涤3次。


SSU rRNA克隆文库和桑格毛细管测序

将5到10个小聚集体用PCR级水均质化，并使用MoBio PowerSoil试剂盒（MoBio，Carlsbad，CA，USA）提取DNA，采用1分钟的珠击步骤代替10分钟的涡旋步骤进行裂解制造商的协议中概述。如所述，细菌16S rRNA基因和真核18S rRNA基因在97%序列相似性阈值下进行PCR扩增、克隆、测序和聚类到操作分类单元(OTU)支持信息S1中。去重复、嵌合体检查的16S rRNA基因序列数据的GenBank登录号是KF512914–KF513148，18S rRNA基因序列数据是KF516997–KF517018。系统发生树是使用RAxML 7.2.8(Stamatakis,构建的，2006)具有1000个快速引导推断和GTRGAMMA速率近似，或使用近似最大似然方法(Price等人，2010)的FastTree构建，具有1000个类似SH的支持，GTRCAT 20个速率类别的近似值。


宏基因组测序和分析


宏基因组测序

如所述，通过Roche GS 454 FLX+、Illumina HiSeq和Illumina MiSeq技术对提取的总群落DNA进行测序支持信息S1中。所有质量过滤、未组装的序列数据均可在NCBI BioProject PRJNA214436的序列读取存档(SRA)登录号SRX332170、SRX332174和SRX332175中获得。数据也可通过MG-RAST服务器在MG-RAST ID 4454153.3、4517592.3和4516362.3下获得。在可能的情况下，使用MG-RAST 3.3管道组装重叠的Illumina MiSeq双端读数（250 bp），并使用M5RNA数据库进行分类，以提供与16S rRNA基因克隆文库平行的多样性描述（Meyer等人，2008年）。为了评估多样性，dsrAB硫循环标记基因的从策划的构建了隐马尔可夫模型（HMM）和全长参考树dsrAB比对（Loy等人，，2009年2009年使用HMMER 3.0和FastTree（Price））等人。,2010)由Phylosift管道实现(Darling et al.,2014)。使用Phylosift管道，使用LAST（Kielbasa扫描Illumina序列读数，使用等人，2011年）HMMER 3.0与参考标记比对，并使用pplacer置于全长dsrAB系统发育树上（Matsen等人，2010年）.


宏基因组组装、基因组分箱和基因组完整性

Roche 454 Titanium和交错双端Illumina HiSeq数据使用idba_ud算法1.0.9(Peng共同组装et al.,2012)。使用来自蛋白质查询，Desulfobulbus propionicus和Allochromatium vinosum的在这个完整的、组装的宏基因组数据的核苷酸数据库上进行了tBLASTn搜索，以确定关键的硫循环功能基因。该数据集已作为全基因组散弹枪(WGS)项目存放在DDBJ/EMBL/GenBank中，编号为AVFP00000000。本文描述的版本为AVFP01000000版本。数据也可通过MG-RAST ID 4532235.3下的MG-RAST数据库获得。

大于1 kb的重叠群使用描述的涌现自组织图谱通过四核苷酸频率合并到基因组中支持信息S1和之前（Dick等人，2009年；Wrighton等人，2012年）中。FigShare(提供了PB-PSB1和PB-SRB1基因组的RAST注释http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.770903)。该基因组项目草案已作为WGS项目存放在DDBJ/EMBL/GenBank中，登记号为AVFQ00000000和AVFR00000000。本文中描述的版本是版本AVFQ01000000和AVFR01000000。


显微镜和nanoSIMS的嵌入和冷冻切片

洗净的浆果在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗1分钟，然后在室温下固定1小时（4%多聚甲醛，0.5%戊二醛的PBS）。固定后，浆果用PBS洗涤3次，并在冷冻保护剂溶液（PBS中的7.5%蔗糖）中孵育>1小时。然后将浆果转移到OCT TissueTek（Sakura，CA，USA）并在液氮中快速冷冻之前使其渗透2小时以上。使用直剃刀低温恒温器在-20°C下以10μm厚度切片冷冻组织块。将用于CARD-FISH杂交和表面反射共聚焦显微镜的样品置于Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides（Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上，而将用于nanoSIMS的样品置于玻璃圆或氧化铟锡(ITO)涂层玻璃上正方形（Dekas和Orphan，2011年）。


CARD-FISH，成像元素硫包裹体和共聚焦显微镜

ARB软件包的探针设计工具(Ludwig et al.,2004)用于为16S rRNA基因克隆文库数据中发现的PB-SRB1系统型创建特定探针。使用BLAST、SILVA数据库（第108版）、核糖体数据库项目和NCBI数据库，针对GenBank数据库检查了针对该序列簇的探针(SRB-PiBe213)的特异性，并且对于目标簇之外的序列没有命中检测到。SRB-PiBe213探针(5'-tcctcctcgcacaaccgc-3')作为偶联物从Biomers(Ulm,Germany)订购。检查通用γproteobacterial探针GAM42a探针序列，发现其靶向PB-PSB1序列。

除了与定制的SRB-PiBe213探针、GAM42A（Manz等人，1992年）和Delta495a-c与竞争对手ac（Lücker等人，2007年年）、真细菌探针EUB338I-III（Amann）杂交之外等人，，1990；Daims等人，1999年）用作阳性对照，无义探针NON338（Wallner等人，1993年）用作非特异性结合的对照。杂交和酪酰胺信号放大如前所述（Ishii等人，2004年）进行，修改在中有详细描述支持信息S1。使用配备彩色相机（AxioCam HRc，Carl Zeiss，Thornwood，NY，USA）的Zeiss Axio IMAGER MZ落射荧光显微镜进行初始成像。使用带有可调白光激光器的Leica TCS SP8X共聚焦显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）进行SRB-PiBE213 CARD-FISH杂交的共聚焦显微镜检查。

如前所述（Pasteris在组织切片上使用Olympus FV1000 LSM通过表面反射共聚焦显微镜对紫色硫细菌细胞中的元素硫包裹体进行成像等，，2001）。简而言之，488 nm激光线用于从具有478-498 nm检测窗口的可折射元素硫颗粒产生反射信号，而使用543 nm激光线和自动过滤器收集来自紫硫细菌细胞的自发荧光Alexa546荧光团的设置。


硫化物消耗测定

在的N在50毫升血清瓶中的缺氧过滤器灭菌的原位沼泽水中建立了三份微观世界，每个小浆果（直径约1-3毫米）2/CO 2含或不含硫化物顶空(90:10)下，添加至终浓度为1 mM。还建立了含有和不含1 mM硫化物的三次非生物对照，并且仅含有经缺氧过滤消毒的原位沼泽水。微观世界在28°C下以14小时光照/10小时黑暗循环培养，并通过分光光度法监测可溶性硫化物（Cline，1969年）。


循环微伏安法

使用手动显微操作器以0.1–1 mm的增量垂直降低玻璃Au-Hg汞齐电极（尖端绘制到约500μm直径）对收集在50 ml Falcon管中的浆果进行伏安分析。根据Brendel和Luther(概述的方法构建和校准电极1995)。在实验室中校准电极的O 2、HS-和Mn 2+使用从样品点收集的水；每个电极的响应在使用前立即通过测量200μM Mn的信号进行检查，2+并在Meites(之后使用先导离子方法进行校准1965)和Slowey和Marvin-DiPasquale(2012)。电极的尖端被定位成使用这种技术穿透许多浆果。浆果通常在电极尖端能够穿透之前稍微压缩，然后浆果本身随着电极的穿透而移动。因此，不可能进行精确的空间参考，尽管很明显在单个浆果内部确实发生了多次扫描。使用DLK-60恒电位仪和软件（Analytical Instrument Systems,Flemington,NJ,USA）在每个位置获得10个循环伏安图序列。测量之间的仪器变异通常小于1%。还根据制造商的说明使用Unisense硫化物微传感器（Unisense，Aarhus，Denmark）独立测量其他聚集体中的硫化物，假设内部pH值为8（Seitz计算总硫化物等，1993）。


δ硫化物捕获和SIMS 7f-Geo离子微探针分析34 S的

收集大浆果（直径0.5-1厘米），冲洗干净，穿入24号银丝（99.95%；美国新泽西州弗洛勒姆公园的Surepure Chemetals），并孵育在原位下午4点至第二天上午11点.然后取出浆果，用去离子水冲洗电线并在分析前储存在氮气氛下。将导线切片，使用双面碳带安装在玻璃圆上，并溅射涂有10纳米的金。在加州理工学院微量分析中心使用Cameca IMS 7f-GEO磁扇形SIMS使用先前描述的方法（例如Fike和Grotzinger，2008年；Fike等人，2008年；Fike等人，2009)并在中有详细说明支持信息S1。


稳定同位素修正实验

缺氧、过滤灭菌的原位沼泽水用修正，13 C富集碳酸氢盐（98原子％13 C，Isotec Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）最终浓度为10 mM，和34 S富集硫酸盐（90原子%34 S，Isotec Sigma-Aldrich），最终浓度为28 mM，在水中天然存在的浓度之上（硫酸盐最初测量为26.5 mM）。将浆果洗去沉淀物并放入血清瓶中孵育，其中硫化物添加到0.5 mM和N 2/CO 2(90:10)顶空。在黑暗或光照（14小时光照/10小时黑暗循环）下，在28°C下培养4天。在10 mM钼酸钠存在下也建立了类似的光/暗孵育，以抑制聚集体中硫酸盐还原细菌的活性。同位素未标记的光和暗对照温育平行温育，并且由在沼泽水中天然存在的物质的顶部等量添加标准同位素组成碳酸氢盐和硫酸盐组成。

4天后，将浆果从孵化中取出，固定、包埋并切片用于nanoSIMS分析。来自光照条件的浆果被切片到玻璃圆片上，随后溅射镀上10纳米的金。将连续的暗培养切片在导电ITO方块上（Dekas和Orphan，2011年）。来自三个黑暗生物复制品（+/-钼酸盐和未标记的对照）的几个浆果被固定并快速冷冻，无需嵌入，以便通过散装元素分析仪同位素比质谱（EA-IRMS）进行分析。


NanoSIMS样品制备和成像

使用相差和落射荧光显微镜对用于nanoSIMS分析的样品进行光学映射，以识别PB-PSB1靶细胞的岛。未对这些样品进行FISH和CARD-FISH以保存细胞内元素硫内含物，发现这些内含物在这些协议所需的透化步骤中会被洗掉。在nanoSIMS分析之前，发现目标PB-PSB1细胞具有丰富的细胞内硫包裹体。

2010年和2011年，在加州理工学院微量分析中心的Cameca NanoSIMS 50 L仪器上进行了两次单独的为期3天的测量。使用初级Cs+离子束在1.2 pA下收集样品，对应于约50 nm的标称光斑尺寸.光束以256×256或512×512像素分辨率在15至30μm大小的方形区域上进行光栅化。所有样品都预先溅射10-15分钟以局部去除任何外层或金涂层。同时收集七个次级离子，12 C-、13 C-、12 C 14 N-、12 C 15 N-、31 P-、32 S-、34 S-。NanoSIMS图像使用“打开MIMS”，一个插件的ImageJ可在线处理http://www.nrims.hms.harvard.edu/NRIMS_ImageJ.php（Gormanns等人。，2012）。每个系列的帧都针对漂移和检测器死区时间进行了校正，但代表了未针对仪器质量分馏进行校正的原始值。显示的值是来自每个分析区域的几个帧的总和。


通过EA-IRMS批量分析硫同位素

原位沼泽水中的硫酸盐用氯化钡沉淀（Kolmert等人，2000年），干燥并准备用于EA-IRMS。从三次孵化保存的粉红色浆果（深色，+/-同位素标记，+/-10 mM钼酸钠）在55°C下干燥48小时，并在密封的铝箔中卷曲。使用ECS 4010元素分析仪（Costech Analytical Technologies,Valencia,CA,USA）与Thermo Finnigan Delta V Plus质谱仪（Thermo Scientific,Waltham,MA,USA）联用分析样品的硫同位素组成。硫同位素组成根据NBS-127、IAEA-S1和IAEA-S3进行校准。相对于V-CDT(Vienna Canyon Diablo Troilite)标度，硫同位素值以每密耳(‰)为单位报告。根据几天内的重复分析，这些硫同位素测量值的重现性<0.3‰(1σ)。


碳固定的放射性碳测定

将五个无沉积物的2毫米直径浆果的孵化放置在带有1毫升过滤消毒的原位沼泽水和N小型螺旋盖管中2/CO 2顶部空间(90:10)的。在环境光、暗或最终浓度为10 mM的钼酸钠中，将重复孵育预平衡3小时。还用热灭活的浆果（煮沸10分钟）制备了重复的小瓶。就在实验开始之前，每次孵育都用中和的硫化物修正至终浓度为1 mM，然后加入10μL 14 C碳酸氢盐的0.01 M氢氧化钠溶液，标称比活为250μCi/ml.在由196个红外发光二极管（λ=850 nm）阵列照明的室温下，孵育1或4小时后取样，以确保任何观察到的碳固定来自紫硫细菌，而不是来自含氧光养生物（硅藻、蓝藻）)在浆果中。

通过添加1 ml饱和尿素溶液并加热至85°C 30分钟以灭活和分解浆果来终止孵育。通过在玻璃闪烁瓶中将50μL浆果匀浆与400μL冰醋酸在65°C下加热20分钟，去除未掺入的放射性碳酸氢盐。在整个加热过程中轻轻敲击小瓶以确保去除边缘附近的任何冷凝物。将10毫升Universol闪烁混合物添加到样品中，并使用LS 650多用途闪烁计数器（Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA）将生物质中的酸稳定产物量化为每秒闪烁次数。


致谢

我们要感谢多年来在海洋生物实验室微生物多样性课程中为这项研究做出贡献的许多学生、教员和讲师的出色工作；我们特别感谢Cristina Moraru和Rebekah J.Ward在开发嵌入和CARD-FISH协议方面提供的帮助、Jarrod J.Scott提供2007年的16S rRNA基因序列数据以及Alexander P.Petroff的有益讨论。非常感谢Douglas C.Nelson和Susan E.Alford在放射性碳固定分析方面的工作，Abigail Green-Saxena和Yunbin Guan协助nanoSIMS数据采集，Fotios C.Kafantaris进行微伏安测量工作，Jennifer Houghton Julie Huber使用感谢她的实验室和Claire Beaudoin进行硫化物微传感器测量，感谢Nanelle R.Barash和Annette R.Rowe对手稿的批判性阅读。这项工作得到了NSF赠款DEB-1310168、EAR-1124389和EAR-1123391、戈登和贝蒂摩尔基金会(#3306)的赠款以及来自美国加州大学戴维斯分校研究生研究奖学金的Elizabeth G.Wilbanks的支持论文年奖学金、PEO学者奖和NAI/APS天体生物学刘易斯和克拉克基金。这项研究由MBL微生物多样性课程的参与者进行，并得到了霍华德休斯医学基金会、戈登和贝蒂摩尔基金会(#2493)、美国国家科学基金会(DEB-0917499)、美国能源部(DE-FG02)的部分支持-10ER13361）和美国宇航局天体生物学研究所。

《盐碱地沼泽中的光养粉红色贝类的微量硫循环》——概括 、介绍

《盐碱地沼泽中的光养粉红色贝类的微量硫循环》——结果

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