干细胞衍生的脑类器官是模仿胚胎大脑结构人工培育的微型器官。它们由多种神经细胞类型组成，具有3D细胞层组织，表现出局部场电位。为了监测厚球形样本的类器官内电活动，此项研究开发了能够穿透脑类器官内部区域的长突起微电极阵列，以测量类器官内神经元的局部电位。研究者们开发出了一种新的微加工工艺，可以在垂直上升的超过两百微米的横梁顶端制造突出的悬臂微电极阵列。这些细长的横梁深深插入类器官内，可以记录埋藏在类器官内的神经元的局部场电位。这种新型装置将为更详细地研究神经功能提供宝贵的工具。


研究思路


Methods开发一种新的微加工工艺，用于制造长的突出式微电极阵列（csMEA），以测量类器官内神经元的局部电位。为了实现这一目标，研究人员首先设计了一个新的微加工流程，然后使用该流程制造了突出式微电极阵列。研究人员将突出式微电极阵列应用于人类大脑类器官中，以测量神经元的电位。最后对实验结果进行了分析和讨论，探讨了该技术在神经科学领域的潜在应用。


主要结果


ResultsMEA设计研究人员设计了一种csMEA，该阵列由许多微小的弯曲和尖锐的微电极组成，可以穿透组织并灵敏地记录局部场电位。为了制造这种阵列，研究人员使用了一种新的微加工技术，该技术可以制造出足够尖锐和细长的微电极，以直接穿透类器官并进行电位测量。此外，研究人员还设计了一个PDMS环，用于将类器官固定在突出式微电极阵列上。为了制造这种阵列，研究人员使用了一种复杂的微细加工流程。该流程包括四个层次的掩膜制作，制作过程从清洗玻璃基板开始，然后在基板上蒸发一层厚度为300μm的铝膜。使用掩膜制作技术，将铝膜刻蚀成所需的形状。然后使用PDMS制作技术制作悬臂式结构，并将其与微电极阵列结合在一起。最后使用化学腐蚀技术将铝膜层溶解，从而形成悬臂式结构。

图1(a)MEA的横截面示意图。(b)在传统平面MEA上放置大脑类器官的示意图以及类器官插入尖刺微电极的示意图。(c)功能MEA的照片，显示PDMS内环和外环。(d)显示与实际光刻掩模相对应的4个不同层次的MEA布局。(e)植入MEA并用PDMS环固定的类脑的3D示意图。


光束释放

光束释放是一种微细加工技术，用于制造悬臂式MEA。该技术利用了光的能量来释放悬臂式结构，从而形成微电极阵列。

图2尖头电极微细加工原理示意图（a）。蚀刻完成后，运动的横梁会放松内应力并伸直（b）。(c)微光束阵列在光束释放前后的光学照片。(d)整个阵列的扫描电子显微镜图像，(e)显示每个光束上活性区域的光束细节。光束正确曲率（f）和过度曲率（g）示例。(h)一根悬臂末端活动区域的细节。

图3(上图）分析机械问题的示意图和长度不断增加的松弛悬臂梁的扫描电镜照片，显示了圆形变形形状以及曲率半径的测量结果。(下图）曲率半径与悬臂厚度的关系，分析模型（蓝线）与测量结果（红点）的比较。


机械建模

在计算受到压力和力矩作用的机械梁和悬臂的变形形状时，可以使用欧拉-伯努利理论或Timoshenko-Ehrenfest梁理论来建立更精细的模型。接下来评估悬臂深入插入hESC衍生脑类器官的能力。为此，研究者们开发了具有突出悬臂的相同装置，为了不影响显微镜观察，没有使用金属层，而是使用与浸入式透镜兼容的薄玻璃。为了进一步了解光束插入类器官的空间情况，对悬臂插入的类器官进行了共聚焦和光片显微镜分析。用PLL-FITC标记悬臂，通过在SiO2和Si3N4上附着聚赖氨酸将荧光素粘合到悬臂上，以便用荧光显微镜观察悬臂。3D观察清楚地表明，横梁插入了类器官中（图4d-f）。


用扫描电镜（SEM）观察悬臂上被刺穿的类器官。在进行扫描电子显微镜分析时，除了固定和干燥外，没有对类器官进行任何特殊处理。结果证实了微光束确实穿透了类器官。如图4b所示，研究首次使用平面MEA对脑类器官进行了电生理学实验。研究者开发了穿透性悬臂，以获得类器官内部的电活动。结果显示，可以在所有类器官中检测到自发信号，每个电极的平均点燃率为每分钟0.5个尖峰（图5d）。将刺入的类器官在MEA上培养了17天，再次进行电记录时，可以看到它们保持了类似的发射率（图5d），这表明该过程在很长一段时间内都是可靠的。这些结果表明，将微电极放置在插入脑器质性模型内部的悬臂上，能够测量因电活跃细胞的电活动而产生的局部电位，其振幅可达几百微伏，具有典型的细胞外记录形状。

图4源自hESC的皮质类器官及其csMEA植入物的表征。(a)用3毫米PDMS环固定在悬臂MEA中心的大脑皮质类器官的透射光显微镜观察；(b)放置在锥形MEA顶部的大脑皮质类器官的透射光显微镜观察。(c)干燥后悬挂在悬臂MEA上的脑类器官的扫描电子显微镜。(d)共焦图像采集：将类器官植入csMEA。(e)悬臂附近细胞的共聚焦成像。(f)类器官脱离csMEA但悬臂仍在其内的光片成像。

图5悬臂微电极显示类器官内部自发的电活动。(a)对整个csMEA阵列进行的5分钟电记录，以及csMEA阵列的代表性照片和示意图。(b)在植入csMEA 3天和17天后，测量植入csMEA的单个类器官的自发活动尖峰。(c)用一个电极记录的类器官植入后24小时和4天的信号轨迹和截图。随着时间的推移，记录到的信号越来越强，可达数百微伏。(d)植入csMEA 3天和17天的脑类器官细胞的平均发射率。


总结


本研究成功制造出了一种新型csMEA和悬臂式MEA，并且对这两种阵列进行了电位测量和性能测试。研究人员还比较了这两种阵列的性能，并发现突出式微电极阵列具有更高的信噪比和更好的空间分辨率，而悬臂式MEA则具有更好的机械稳定性和更高的灵敏度。此外，研究人员还使用这两种阵列对脑类器官进行了电位测量，并成功记录到了神经元的活动信号。这两种新型的微电极阵列，为神经科学研究提供了新的工具。这些阵列具有高精度、高效率和可重复性的优点，可以用于记录神经元的活动信号，并研究神经系统的功能和疾病机制。此外，本文还介绍了一些新的微细加工技术，如光束释放和PDMS环制作技术，这些技术可以用于制造其他类型的微电极阵列和微型传感器。因此，本文的研究成果对于微电子学和神经科学领域的研究具有重要的意义。