研究简介:研究了槟榔碱对PC12细胞的神经毒性作用，特别关注了内质网应激和内源性硫化氢（H2S）生成紊乱在其中的作用。槟榔碱是槟榔中的主要生物碱，已知对中枢神经系统有影响，并与多种神经退行性疾病有关。研究发现槟榔碱处理的PC12细胞表现出活力下降、细胞凋亡增加以及caspase-3活性上调，这些都是神经毒性的标志。此外，槟榔碱还增加了促凋亡蛋白Bax的表达，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，导致细胞凋亡。同时槟榔碱还引发了PC12细胞的内质网应激反应，表现为GRP78、CHOP和裂解Caspase-12表达的上调。槟榔碱处理降低了培养上清液中的H2S水平以及β半胱氨酸合成酶和3-巯基丙酮酸硫基转移酶的表达，这两种酶是PC12细胞中产生内源性H2S的两种主要酶。这些结果表明槟榔碱诱导的神经毒性可能与细胞内ER应激和内源性H2S生成紊乱有关，这为未来治疗槟榔碱引起的神经毒性提供了潜在的干预靶点。研究结果强调了调节细胞ER应激和内源性H2S生成可能是治疗槟榔碱导致的神经毒性的潜在疗法。


Unisense微呼吸系统的应用


Unisense微电极微呼吸系统应用于测量PC12细胞培养上清液中的硫化氢（H2S）含量测定。使用Unisense 硫化氢电极（型号H2SMRCh，Unisense）和配套的皮安培放大器，测定了经槟榔碱处理后PC12细胞培养上清液中的H2S浓度。首先对unisene硫化氢微电极进行预极化，直到其显示稳定信号至少10分钟。然后将1mL的培养上清液注入微呼吸瓶中，并记录电信号。


实验结果


研究发现槟榔碱对PC12细胞具有神经毒性作用，这表现为细胞活力的显著下降、细胞凋亡的增加以及caspase-3活性的上调。槟榔碱处理的PC12细胞中，促凋亡蛋白Bax的表达增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，这表明槟榔碱可能通过影响线粒体途径诱导细胞凋亡。槟榔碱诱导的PC12细胞中，内质网应激标志物GRP78、CHOP和裂解caspase-12的表达增加，说明内质网应激在槟榔碱引起的神经毒性中可能发挥了作用。槟榔碱处理降低了PC12细胞培养上清液中的H2S含量，并且减少了β半胱氨酸合成酶(CBS)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-MST)的表达，这两种酶是产生内源性H2S的主要酶。研究结果表明，调节细胞内质网应激和内源性H2S生成可能是治疗槟榔碱诱导神经毒性的潜在疗法。

图1、槟榔碱对PC12细胞活力的影响。PC12细胞经0.1、0.5、1和2mM的槟榔碱处理24小时后，用CCK-8检测法测定细胞活力。数值与对照组的平均值(100%)进行归一化，以平均值±S.E.M.表示，n=3。

图2、槟榔碱对PC12细胞凋亡的影响。PC12细胞分别用0.5、1和2mM的槟榔碱处理24小时。A，荧光显微镜(200×)显示了用Hoechst 33258染色的PC12细胞的核形态。细胞核发出明亮荧光并破碎的细胞代表凋亡细胞。B，caspase-3活性通过Elisa进行评估，每个实验条件下获得的caspase-3活性水平以对照的倍数计算。C，凋亡细胞的百分比通过annexinV-FITC/PI染色进行量化。数据为三个独立实验的代表性图像，数值为平均值±SEM，*P<0.05；**P<0.01，与对照组相比。

图3、槟榔碱对PC12细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。用抗Bax抗体和抗Bcl-2抗体分别对PC12细胞中Bax(a)和Bcl-2(b)蛋白的表达进行免疫印迹检测。在所有印迹中，β-actin均用作负载对照。数据为三个独立实验的代表性图像，数值为平均值±SEM，*P<0.05；**P<0.01；与对照组相比。

图4、槟榔碱对PC12细胞内质网应激的影响。PC12细胞经0.5、1和2mM的槟榔碱处理24小时后，用Western印迹法测定葡萄糖调节蛋白78(GRP78)(a)、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(CHOP)(b)和裂解的caspase-12蛋白(c)的表达。在所有印迹中，β-actin均用作负载对照。

图5、槟榔碱对PC12细胞产生内源性H2S的影响。a如“材料与方法”一节所述，用单义硫化氢微电极检测细胞培养上清中H2S的含量。PC12细胞中CBS蛋白(b)和3-MST蛋白(c)的表达量通过Western印迹法测定。Western印迹图像显示了三个独立实验的代表性结果。在所有印迹中，β-actin均用作负载对照。


结论与展望


槟榔碱是槟榔的一种主要生物碱，对中枢神经系统有影响。虽然有报道称槟榔碱会诱发神经中毒，但其潜在的神经中毒机制尚未阐明。越来越多的证据表明，过度的内质网(ER)应激和硫化氢(H2S)生成紊乱参与了多种神经退行性疾病的病理生理学过程。本研究旨在验证内质网应激和内源性硫化氢(H2S)生成紊乱是否也参与了槟榔碱引起的神经毒性。使用Unisense H2S微呼吸电极，研究人员能够精确地测定经槟榔碱处理后PC12细胞培养上清液中的H2S浓度。这对于评估槟榔碱对内源性H2S生成的影响至关重要，这些数据支持了槟榔碱通过干扰内源性H2S生成而发挥神经毒性作用的假设。研究发现用槟榔碱处理PC12细胞会导致细胞活力下调、细胞凋亡和caspase-3活性上调，这表明槟榔碱对PC12细胞具有神经毒性作用。此外槟榔碱还增加了PC12细胞中Bax(促凋亡蛋白)的表达，降低了Bcl-2(抗凋亡蛋白)的表达。同时槟榔碱还导致PC12细胞ER应激反应过度，表现为葡萄糖调控蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和裂解Caspase-12表达的上调。值得注意的是，培养上清液中的H2S水平以及β半胱氨酸合成酶和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(PC12细胞中产生内源性H2S的两种主要酶)的表达量也因槟榔碱处理而降低。这些结果表明，槟榔碱导致的PC12细胞神经毒性与细胞ER应激和内源性H2S生成紊乱有关，并表明调节细胞ER应激和内源性H2S生成可能是治疗槟榔碱导致的神经毒性的潜在疗法。