3讨论


土壤含水量是控制N2O排放的主要因素，它对N2O产生途径及同位素组成均具有显著影响。该研究表明土壤N2O排放量随土壤含水量的增加而增加，这与前人的研究结果一致。含水量从67%升高到95%WFPS，土壤N2O排放量出现显著增加。这与温带大田土壤的研究结果相似，Clayton通过研究草地土壤发现，65%WFPS是一个重要临界点，当超过该含水量，土壤N2O排放量出现显著增加。温带草地和农田土壤含水量从60%升到80%WFPS时，N2O排放量分别增加了12倍和30倍，这与本研究结果相似，高、中含水量土壤N2O累积排放量分别比低含水量处理高13.23倍和2.22倍，这可能是由于随着土壤含水量（WFPS）的增加，水不断充满土壤孔隙，O2向土壤中扩散受到限制，土壤的厌氧条件逐渐增强并促进反硝化作用，N2O也随之大量产生并排放出土壤。随着土壤含水量（WFPS）增加，N2O排放量增加，在含水量为80%—95%WFPS条件下出现最大的N2O排放量。当土壤水势达到-5 kPa（约为97%WFPS），出现最大的N2O排放量，土壤含水量（-2.5 kPa）进一步增加，N2O产生量减少，可能是由于N2O还原速率增加。但是，也有研究提出在70%WFPS下出现较高的N2O排放量。Davidson研究发现，最大N2O排放量产生于60%WFPS，硝化作用和反硝化作用对N2O产生均具有重要作用。出现该矛盾原因可能是由试验和土壤类型的不同导致。

表3不同含水量土壤硝化和反硝化作用对N2O排放的贡献率


同一土体中可以同时发生多个N2O产生过程，利用稳定同位素与C2H2（0.1%和10%V/V）抑制相结合的方法可以确定自养硝化作用和反硝化作用对土壤N2O排放的贡献率。本研究发现自养硝化作用和反硝化作用对土壤排放N2O的贡献率随着土壤含水量的变化而有所不同，但绝对贡献率因所选择的方法不同有很大的差异。仅利用乙炔抑制技术估测的反硝化作用（含水量为67%—80%WFPS时贡献率为82%—83%）对N2O排放贡献率大于同位素技术（含水量为67%—80%WFPS时贡献率为32%—58%）测得的结果，利用两种方法估测反硝化作用对N2O排放的贡献率，大于25%的差异仅出现在67%WFPS条件下，这有可能是乙炔抑制技术忽略了异养硝化作用对土壤排放N2O的贡献。但是，不同途径对土壤N2O排放的贡献随着土壤含水量的变化趋势是相同的。


在大部分生态系统中，反硝化作用是主要的N2O产生途径。其最后一步是N2O还原酶将中间产物N2O还原成N2的过程，这步反应对估测N2O消耗、了解土壤中氮积累和排放到大气中的气态氮量至关重要，并且这可能是如何减缓N2O排放的重要方向。反硝化产物N2O/（N2O+N2）比率用于评估N2O转化为N2的程度，变化范围从0（所有的N2O全部转化为N2）到1（N2O是反硝化过程的唯一最终产物）。本研究发现，土壤含水量越高，土壤排放的N2O转化成N2的比例越高，土壤排放到外界环境的N2O绝对量也越高。这将会导致更多的N2O排放到大气中，加剧温室效应。之前的一些研究也提出较高含水量的土壤出现最大的N2O排放量，这与本研究结果一致。这说明可以通过控制土壤水分条件来减缓N2O排放。


一些文献报道δ15Nbulk是区分硝化作用和反硝化作用的重要指标，这是因为与反硝化作用相比，硝化作用会加速δ15N-NO-3贫化，其他学者主张δ15Nbulk取决于底物来源NH+4和NO-3以及土壤异质性，并没有考虑N2O还原过程对剩余N2O的影响。本研究发现施用NH+4后，由于硝化过程中同位素分馏导致δ15Nbulk值随着培养时间逐渐升高。底物（NH+4）充足，硝化作用产物NO-3受底物影响，根据同位素分馏原理，微生物优先利用轻同位素，导致δ15N-NO-3逐渐贫化，而发生反硝化作用的底物几乎全部来自于硝化作用产物（NO-3），故反硝化作用占据主导地位的较高土壤含水量，其δ15Nbulk值越低，本研究显示δ15Nbulk值随着含水量的增加而降低（δ15Nbulk加权平均值，95%WFPS处理＜80%WFPS处理＜67%WFPS处理）。


δ18O值受N2O向N2还原过程的影响，同时O2，H2O与NO-3之间的O原子交换也会影响其大小。与δ15Nbulk和SP相比，对N2O分子中δ18O的解释更为复杂。N2O-O可能来源于不同途径，理论上，硝化细菌-反硝化过程中（NH+4→NH2OH→NO-2→NO→N2O）一半的氧原子来自于空气中O2，另一半氧原子来自于H2O，羟胺氧化过程中，100%的N2O-O来源于O2。如果反硝化细菌利用NO-3产生N2O，那么N2O中所有的O都来自于NO-3。但是在实际环境中，H2O-O与NO-2-O和NO-3-O发生氧交换，且H2O-O和NO-3-O对N2O-O的贡献与微生物种类有关。基于以上理论和研究结果，采用δ18O-N2O值对N2O来源进行分析比较复杂，需要考虑多种因素。本试验中，δ18O与乙炔抑制技术相结合，提高了其准确性。各含水量土壤中，0.1%（V/V）C2H2处理组的δ18O值显著高于10%（V/V）C2H2处理组（＜0.01），这可能是由于两种处理土壤中均主要发生反硝化作用，只是10%（V/V）C2H2会抑制土壤中N2O还原成N2的过程，而反硝化作用会消耗土壤中的NO-3，并使土壤中剩余NO-3富18O，增加其δ18O值。有研究提出，反硝化过程中发生N2O还原会使N-O键断裂，导致剩余N2O相对富集δ15Nα和δ18O。尽管一些研究中利用δ18O来区分N2O产生途径，但是只依靠δ18O-N2O值对N2O来源进行分析仍备受争议，如果δ18O与其他同位素值（如δ15N，SP）结合来分析，可能会提高其准确性。


与δ15Nbulk和δ18O相比，SP值是区分土壤N2O排放途径的一种重要工具，其优势在于受样品干扰小，与N2O前体的δ15N同位素组成没有相关关系。一般随着土壤含水量（WFPS）的增加，土体的厌氧体积逐渐增大并使反硝化作用加强，N2O也随之大量产生并排放出土壤。本研究高含水量处理厌氧体积高于中含水量处理，其SP值之所以高于中含水量处理，可能是发生了部分真菌反硝化作用。Maeda等通过对67种真菌测试发现，其SP平均值为30.0‰±4.8‰（变化范围为15.8‰—36.7‰）。另有文献报道真菌产生N2O的SP值为36.9‰—37.1‰，这与细菌硝化作用的相似（34.1‰—39.6‰）。


本研究利用同位素技术结合乙炔抑制技术，高含水量处理中，加10%（V/V）C2H2只发生反硝化作用，其会抑制自养氨氧化过程和N2O还原成N2的过程，故该处理不会因为这两个过程而产生较高的SP值，而95%WFPS在10%（V/V）C2H2条件下土壤排放N2O的SP加权平均值为15.71‰，这正说明高含水量处理中发生部分真菌反硝化作用。与细菌反硝化作用相比，真菌反硝化作用和硝化作用排放N2O的过程均会产生较高的SP值。因此，利用同位素技术区分细菌硝化作用和真菌反硝化作用产生的N2O遇到挑战。另外，较高土壤含水量更有利于反硝化反应的发生，而施加硫酸铵后，虽然同样产生厌氧环境，由于硫酸铵提供大量可利用氮，在土壤表层硝化反应得到促进。除此之外，SP值会随着N2O还原过程发生变化，使对N2O产生途径评估产生偏差。由完全的硝化作用和细菌反硝化作用产生N2O的SP值，分别约为33‰和0‰，还原过程会使SP值升高，这与本研究结果一致。高、中和低含水量土壤，10%（V/V）C2H2处理组N2O累积排放量分别比0.1%（V/V）C2H2处理增加了26%、40%和16%，说明未加10%（V/V）C2H2处理的土壤发生N2O还原过程；同时，与10%（V/V）C2H2处理相比，0.1%（V/V）C2H2处理下高、中和低含水量的SP加权平均值分别升高了11%、49%和7%，这正验证了该理论。根据同位素二源混合模型，以上过程会使由SP值估测的N2O产生途径低估反硝化作用对N2O排放的贡献。


与示踪技术相比，利用自然丰度同位素技术（例如SP值的运用）不需要人为标记培养、操作方便，具有明显优势。但是微生物氮循环过程相当复杂，对SP值用于区分N2O产生途径的方法应慎重利用，如硝酸盐异化还原成铵和异养硝化作用也会产生N2O，并影响氮循环过程中一些含氮化合物的同位素特征值。目前为止，这些过程对土壤产生N2O的15N的SP值的影响还不明确。因此，本研究并未对这些过程对SP值的影响进行分析。虽然SP值在应用中存在一些不足，但其确实是一种有效的N2O溯源方法，并已在国际上得到广泛认可。当下中国对SP值研究刚刚起步，本文对其进行初步探讨，接下来将进一步探究微生物群落结构及其酶组成对土壤产生N2O的同位素特征值随时间变化的影响，从而能提高利用SP值区分N2O产生途径的准确性；另外，土壤反硝化的NO-3还原成N2O过程中，真菌和细菌反硝化作用对土壤产生N2O的贡献及其对SP值变化的影响，也需要做进一步研究。


4结论


本试验将自然丰度的同位素技术与乙炔抑制技术相结合测定不同含水量（WFPS）下硝化作用和反硝化作用对土壤N2O排放的贡献率。随着土壤含水量增大，N2O排放量增加。各处理均在前4天具有较高的N2O排放量，之后排放量相对较小，并且变化不大。随着土壤含水量增加，N2O/（N2O+N2）比率降低，土壤以N2O形式排放到大气中的比例降低，以N2形式排放到大气中的比例升高，N2O还原过程增强。本研究通过SP值估算硝化和反硝化作用的贡献率得出，培养前7 d内，67%WFPS土壤N2O排放以硝化作用为主，且在前2 d以反硝化作用为主，之后主要通过硝化作用排放N2O。在一定范围内，含水量升高会使反硝化作用增强。