研究简介:好氧土壤细菌通过从大气中清除分子氢（H2）来维持生存。这一关键过程是生物地球化学氢循环中的主要汇，支持了贫营养生态系统的生产力。在分枝杆菌属的M.smegmatis中，大气H2氧化由两种系统发育不同的[NiFe]-氢化酶，Huc（2a组）和Hhy（1h组）催化。然而目前尚未解决这些酶如何将从H2氧化中得到的电子传递到有氧呼吸链的问题。在这项研究工作中，研究人员使用遗传学方法确认了在氢化酶结构操纵子上编码的两种假定铁硫簇蛋白，HucE和HhyE，对M.smegmatis中的H2消耗是必需的。序列分析显示，这些蛋白虽然具有同源性，但属于不同的系统发育分支，并具有不同的金属结合基序。当编码这些蛋白的基因被单独删除时，H2氧化减少，并且在组合删除时被消除。相应地，这些缺失菌株的生长产率和长期存活能力与亲本菌株相比适度但显著地降低。在生化和表型实验中，缺乏假定铁硫蛋白的突变菌株模拟了氢化酶结构亚基突变株。


假设这些蛋白介导氢化酶的催化亚基和M.smegmatis呼吸链中的甲萘醌池之间的电子传递；然而其他角色（例如在成熟阶段中）也是可能的，需要进一步的工作来解决它们的角色。这些蛋白在大多数编码Hhy或Huc的有机体中的保守性表明，这些蛋白是大气H2氧化的重要决定因素。


Unisense微呼吸系统的应用


Unisense微呼吸系统被用来测量和分析M.smegmatis（一种分枝杆菌）在不同遗传背景下的氢气（H2）消耗速率。首先在含有甘油的Hartmans de Bont(HdB)最小培养基中培养M.smegmatis的野生型和衍生突变株，直到达到中期静止相。使用Unisense H2微呼吸微传感器电极，将其在+800 mV的电压下极化1小时，并使用已知浓度的H2标准进行校准。在1.1 mL的微呼吸测试瓶中，先后加入静止相菌液培养物（0.9 mL，OD600=3.0）、H2饱和PBS（0.1 mL）和O2饱和PBS（0.1 mL）。使用Unisense Logger Software记录H2浓度的变化。当观察到H2浓度呈线性变化时，计算20秒内H2消耗的速率。


实验结果


研究确认了HucE和HhyE两种假定的铁硫蛋白对于M.smegmatis中H2的消耗至关重要。这些蛋白对于维持氢化酶的活性和细菌的生存能力发挥着必不可少的作用。当HucE和HhyE基因被敲除时，观察到H2氧化速率显著降低，表明这两种蛋白对于氢化酶的功能至关重要。缺乏HucE和HhyE的突变株在生长产率和长期存活能力上表现出降低，这与之前关于氢化酶结构亚基敲除株的研究结果一致。尽管HucE和HhyE在序列上具有一定程度的相似性，但它们在功能上不具有冗余性。在单突变株中没有观察到对氢化酶活性的补偿现象。HucE和HhyE在大多数编码Hhy或Huc的有机体中是保守的，这表明这些蛋白在大气H2氧化中可能具有普遍的重要性。HucE和HhyE可能在氢化酶催化亚基和M.smegmatis呼吸链的甲萘醌池之间介导电子传递的假设。

图1、与2a组和1h[NiFe]-氢化酶相关的HucE和HhyE蛋白的系统发育树。该树可视化了52个全长HucE和26个全长HhyE序列的代表性子集之间的进化关系。强调了耻垢分枝杆菌编码的蛋白质。该树是使用最大似然法（用部分删除处理间隙）构建的，用100个重复进行引导，并在中点扎根。

图2、耻垢分枝杆菌。野生型、衍生突变体和互补突变株的氢氧化。使用Unisense微呼吸H2电极通过电流分析法测量整个细胞在中期稳定期（OD max∼3.0后72小时）对H 2的吸收。(A)铁硫蛋白野生型、单突变体和双突变体(ΔhucE、ΔhhyE、ΔhucEΔhhyE)以及氢化酶结构亚基单突变体和双突变体(ΔhhyE)之间H 2氧化速率的比较hucS，ΔhhyL，ΔhucSΔhhyL)。(B)分别用hucE和hhyE的表达补充的ΔhucE和ΔhhyE菌株中的H 2氧化速率。对照包括用空载体pMV261转化的野生型、ΔhucE和ΔhhyE菌株以及用互补载体pMV hucE和pMV hhyE转化的野生型菌株。

图3、耻垢分枝杆菌野生型、衍生突变株和互补突变株中的氢化酶活性染色。全细胞裂解物用于在富含H 2的气氛中以硝基蓝四唑作为人工电子受体对H 2摄取进行酶谱染色。(A)野生型、ΔhucS、ΔhucE、ΔhucSΔhhyL、ΔhucEΔhhyE、以及互补的ΔhucE和野生型耻垢分枝杆菌（带有空pMV261或互补载体pMV hucE）培养物的Huc活性染色）在早期稳定期（OD max∼3.0后24小时）收获。(B)野生型、ΔhhyL、ΔhhyE、ΔhucSΔhhyL、ΔhucEΔhhyE和互补的ΔhhyE和野生型耻垢分枝杆菌（带有空pMV261或互补载体pMV hhyE）培养物的Hhy活性染色）在中期稳定期（OD max∼3.0后72小时）收获。

图4、耻垢分枝杆菌。野生型和突变株的生长和存活率比较。七个菌株在补充有Tween80(LBT)的溶源肉汤中生长：铁硫蛋白的野生型、单突变体和双突变体(ΔhucE、ΔhhyE、ΔhucEΔhhyE)，以及氢化酶结构亚基的单突变体和双突变体ΔhucS，ΔhhyL，ΔhucSΔhhyL）。(A)指数期的特定生长率(μ)。(B)稳定期后24小时的最终生长产量(OD max)。(C)稳定期后21天的长期存活率(CFUmL–1)。

图5、编码氢化酶的微生物中HucE和HhyE蛋白的分布。(a)编码2a组[NiFe]-氢化酶的细菌基因组中HucE蛋白的分布。(b)编码组1h[NiFe]-氢化酶的细菌和古细菌基因组中HhyE蛋白的分布。基因组的颜色取决于是否存在全长蛋白质，是否存在截断的蛋白质，或者蛋白质是否缺失。


结论与展望


本研究主要介绍了分枝杆菌属（Mycobacterium）中的M.smegmatis如何通过氧化大气中的分子氢（H2）来维持生存，这一过程对生态系统的生产力和生物地球化学循环具有重要意义。研究着重于两个关键的[NiFe]-氢化酶：Huc和Hhy，以及它们相关的假定铁硫蛋白HucE和HhyE。


好氧细菌通过有氧呼吸利用大气中的H2，这是全球氢循环中的主要过程，并且对低碳土壤生态系统的生产力和生物多样性起着支持作用。尽管已知M.smegmatis通过两种氢化酶进行H2氧化，但这些酶如何将电子传递到有氧呼吸链的具体机制尚不清楚。本研究通过遗传学方法，构建了HucE和HhyE基因的敲除突变株，以探究这些蛋白在H2消耗中的作用。研究发现，单独删除这些基因或同时删除两者都显著降低了H2的氧化速率，并且这种降低与氢化酶结构亚基突变株中观察到的减少相似。此外缺乏这些铁硫蛋白的突变株在生长产率和长期存活能力上也表现出适度但显著的降低。研究结果支持了HucE和HhyE在H2氧化中发挥关键作用的假设，并且这些蛋白可能在氢化酶催化亚基和M.smegmatis呼吸链的甲萘醌池之间起电子传递的作用。


尽管这些蛋白在序列上具有相似性，但它们在功能上不具有冗余性，因为单突变株之间没有观察到对氢化酶活性的补偿。还同步探讨了HucE和HhyE在不同细菌中的保守性和它们在进化上的分布，表明这些蛋白在大多数编码Hhy或Huc的有机体中是保守的，暗示它们在大气H2氧化中的重要性。


unisense微呼吸测量技术被用于评估野生型和突变株M.smegmatis的氢化酶活性。通过测量细胞在存在氢气时的呼吸速率，研究者可以确定氢化酶的功能状态。通过测量氢气消耗速率，研究者能够间接评估不同菌株的生长产率和长期存活能力。这是因为氢化酶活性与细菌的生长和生存能力密切相关。unisense微呼吸测量提供了定量的数据，使得研究者能够精确地计算氢气消耗速率，并据此评估氢化酶活性和细菌的代谢状态。


研究的结论强调了进一步工作的必要性，以解析这些蛋白在氢化酶活性中的具体功能，包括它们是否直接与氢化酶相互作用，以及它们在氢化酶成熟过程中可能扮演的角色。这项研究不仅增进了我们对分枝杆菌能量代谢的理解，揭示了铁硫蛋白HucE和HhyE在分枝杆菌属中H2代谢和生存中的关键作用，而且为开发新的微生物能源策略提供了潜在的靶点。通过对这些关键蛋白的功能研究，可以更好地利用细菌的代谢能力，为生物能源生产和环境修复提供新的途径。