研究简介:微生物附着在惰性表面和生物表面上，很容易形成生物膜这在医疗环境中尤其成问题，因为干燥的表面生物膜可以在多种表面上存活很长一段时间。生物膜中的微生物群落对杀菌剂、抗生素和物理压力不太敏感因此，干燥的表面生物膜可以在卫生保健相关感染的传播中发挥重要作用，而干燥的环境表面是病原体转移的持续来源。铜和铜合金表面近年来受到越来越多的关注，作为一种减少细菌附着和生物膜以及随后在医疗机构中病原微生物传播的方法，从而有可能减轻医院介导感染的发生。在干燥的铜表面上，细菌是通过接触介导的杀灭过程被杀灭的铜从表面溶解并积累在金属基质和细菌细胞之间的水界面，导致严重的膜损伤和细胞质中的铜离子过载。考虑到铜银合金是一种电化学活性表面，并且预期与其他铜合金表面有不同的行为，这种合金的抗菌效果可能会在这种干燥的情况下得到增强表面接触是铜合金表面公认的主要杀伤因素，杀伤率对任何实际应用都至关重要。此外有证据表明，在表面接触建立后，杀灭过程立即启动，铜离子的暴露表面积和释放速率容易影响接触杀灭的总体速率。因此本研究的目的是确定铜银合金涂层在更接近真实条件下的抗菌活性，例如，在允许细菌生物膜形成的干燥条件下。


Unisense微电极系统的应用


pH测量采用pH微电极(PH25，针尖直径≈25μm,Unisense A/S)，pH值在pH 4~9之间呈线性变化，90%响应时间<10 S。pH微电极与参比微电极(REF-100，端径≈100μm;Unisense A/S)浸入琼脂糖基质，以确保与微电极的电接触。pH微电极根据三个pH缓冲液(pH 4.01,7.00和10.01，在实验温度下)的传感器读数进行校准，在校准范围内与pH值线性响应。pH微电极连接到万用表(Unisense a/S)，在PC运行软件(SensorTrace Suite;Unisense/S)。在操作过程中，微电极传感器被安装在一个pc接口的电动微操作器(MM33-2,MC-232）上定位。将接种的凝胶基体放置在铜银合金涂层或未涂层的AISI 316基板载体(25×75 mm)上，并将电极小心地放置在与金属表面的安全距离(<100μm)处，速度越快越好。为了捕捉初始pH上升，传感器被放置在靠近表面(<100μm)，0.5%低熔点琼脂糖(超纯LMP琼脂糖，Invitrogen，美国)沉积在传感器和参考电极尖端的表面。


实验结果


研究了铜银合金涂层在干燥和现实生活条件下对细菌污染的抗菌性能。使用美国环保局的测试方法作为消毒剂和持续减少细菌污染的效果，并通过CLSM直接可视化。该合金成功通过了EPA两种测试方法的验收标准，在接触2小时后，还原百分比等于或大于99.9%，在24小时时间间隔内，还原百分比大于99.9%。在铜银合金涂层和非涂层表面接触杀灭的现场监测中，我们发现金黄色葡萄球菌8325对细菌生物膜的杀灭率高于铜绿假单胞菌PAO1。对铜银合金涂层表面的pH测量和监测显示，当金黄色葡萄球菌8325悬浮液存在于表面和琼脂糖盐基质之间的界面时，20分钟后pH值迅速增加，并在pH 9.0时达到平台期。

图1、铜绿假单胞菌PAO1活细胞和死细胞暴露于a-d)铜银合金涂层和e-h)未涂层AISI 316表面在a开始时监测，e)暴露后，b,f)10分钟，c,g)25分钟和d,h)60分钟。箭头表示金属表面的位置。细胞用改良活/死染料染色混合物(0.2%SYTO 9绿色荧光核酸和0.2%SYTOX AADvanced死细胞染色)染色，活细胞呈绿色，死细胞呈红色。

图2、铜绿假单胞菌PAO1活细胞和死细胞暴露于a-d)铜银合金涂层和e-h)未涂层AISI 316表面在a开始时监测，e)暴露后，b,f)10分钟，c,g)25分钟和d,h)60分钟。箭头表示金属表面的位置。细胞用改良活/死染料染色混合物(0.2%SYTO 9绿色荧光核酸和0.2%SYTOX AADvanced死细胞染色)染色，活细胞呈绿色，死细胞呈红色。

图3、金黄色葡萄球菌8325活细胞和死细胞的比例a)铜银合金涂层和b)未涂层AISI 316表面和铜绿假单胞菌PAO1活细胞和死细胞暴露于c)铜银合金涂层和d)未涂层AISI 316表面。

图4、用0.15 m NaCl 0.5%琼脂糖基质加载金黄色葡萄球菌8325悬浮液对镀铜银合金和未涂覆SS316表面的pH值进行监测。*由于传感器定位较慢，该复制用模型(在实验部分表明)进行了拟合，该模型允许外推其初始pH上升。

图5、在未加载0.15 m NaCl 0.5%琼脂糖基质下，铜银合金涂层和未涂层SS316表面的pH监测。


结论与展望


本研究设计了一种定制的共聚焦成像协议，可以实时可视化铜银合金表面细菌生物膜的杀死过程，并监测100分钟的动力学。铜银合金涂层在5分钟内根除革兰氏阳性细菌的生物膜，而革兰氏阴性细菌的生物膜则被杀死得更慢。原位pH监测（unisense微电极剖面分析系统）表明，在金属表面和细菌生物膜之间的界面增加了2 log单位;然而，当在缓冲液中测试时，细菌的活力不受这个提高(pH 8.0-9.5)的直接影响。OH−的产生是电化学活性表面与细菌生物膜在环境条件下相互作用的结果，因此是铜银合金涂层接触介导杀灭的一个方面，而不是观察到的抗菌效果的直接原因。细菌细胞的氧化、铜离子的释放和局部pH值的提高共同决定了铜银合金涂层干表面的抗菌活性。