硝化作用是氨被微生物氧化为硝酸盐的过程，硝化作用是自然界中连接氧化态和还原态无机氮库的唯一生物学过程，在维持全球氮素平衡中起着关键作用分别由氨氧化微生物(AOB和AOA)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)主导完成。论文研究了几种不同的经过纯培养的硝化细菌(Candidatus Nitrospira nitrosa、Candidatus Nitrospira nitrificans和Candidatus Nitrospira inopinata)和一种未经过纯培养的细菌(类Nitrospira)，它们都具备单独将氨氧化为硝酸盐的能力，这些微生物被定义为全程氨氧化微生物(Comammox)。本论文主要就微生物的硝化反应动力学过程进行相关研究，研究过柱中主要应用了微呼吸系统结合氧电极测试这几种硝化微生物菌的硝化过程以及结合测试体系中氧浓度的变化情况来判断这些微生物菌在低营养环境中的硝化反应的动力学


Unisense微电极分析系统的应用


应用unisense微电极分析系统测试，结合一个2ml的玻璃微呼吸瓶，其中使用微呼吸氧电极的尖端为500um，其中氧电极在使用前已经极化了7天，其中玻璃材质的微呼吸瓶放置在循环水浴锅中，使用氧气微电极测试生物的微呼吸速率。其中食心虫网螟微生物的微呼吸测试的环境温度为37度，螨虫的呼吸速率是在42度的环境下，微呼吸瓶中放有培养基，培养基靠近微呼吸瓶的注释器的针尖端，这样可以确保微呼吸瓶中的不会形成顶部空间，微呼吸瓶中还放有搅拌子，搅拌速度为200-400rpm的转速。


实验结果


铵盐和亚硝酸盐氧化被认为是通过氨氧化细菌（AOB）以及氨氧化古菌(AOA)和亚硝酸盐氧化菌共同作用完成的。研究发现硝化螺菌属有全程氨氧化菌(comammox)，该菌属可以独将氨转化成硝酸盐，孤立的进行comammox细菌和inopinata硝化螺菌属的纯培养，发现他们能够适应于贫瘠和动态栖息地环境下缓慢生长，是基于这类菌对氨的高亲和力和低的最大氨氧化速率，而与规范氮化物收益率相比具有高增长率，替代新陈代谢的基因潜力。对来自于土壤的和温泉AOA菌的硝化动力学比较。我们发现AOA与全程氨氧化菌(comammox)相比，在贫营养的环境中并不具备很好的氨氧化性能，而N.inopinata菌与铵盐底物具有很好的亲和力.这表明全程氨氧化微生物（comammox）在贫瘠和动态环境条件下能够发生硝化作用,能够将铵盐直接转换为硝酸盐。

图1、N.inopinata细菌和三种氨氧化奇古菌的氨的氧化动力学研究。a-d代表的是不同氨氧化菌的中在不同浓度的氨盐环境下的氨氧化速率。其中图a表示的是N.inopinata细菌，图b表示的是Nirospira gargensis氨氧化菌，图c表示的是Nirospira viennesis菌；图d表示的是Ca Nitrosotenuis uzonesis菌。从图中可以看出，随着氨盐浓度的增加，不同氨氧化菌进行氨氧化的速率呈现非线性关系，先增长后慢慢趋于平衡。而体系中铵的浓度检测是基于氧消耗计算出来的。

图2、N.inopinata菌的亚硝酸盐氧化动力学研究。亚硝酸盐的氧化速率是基于亚硝酸微传感器计算出来的，而亚硝酸微传感器是通过微呼吸电极测试环境中的氧的消耗情况以及培养基底物浓度的变化斜率换算出亚硝酸盐的浓度变化。其中半饱和参数和亚硝酸盐的最大铵氧化速率是结合Michaelis-Menten反应动力假说方程非线性拟合得出的。其中红色的线代表的是拟合线，圆点代表的是实际测试数据点。

图3、不同的总铵浓度对于三种氨氧化菌（Nitrospira inopinata,Nitrososphaera gargensis,Nitrosospira spp）的氨氧化速率的影响。其中氨氧化速率是通过氨氧化动力反应过程来表达的。其中Nitrospira inopinata菌和Nitrososphaera gargensis菌的氨氧化速率是基于动力学参数计算获得的。Km(app)（半饱和参数）and Vmax（最大铵氧化速率）是基于Michaelis-Menten反应动力假说方程非线性拟合获得的。

图4、N.inopinata isolate菌的扫描电镜形态图以及其硝化活性性能分析。其中图a表示的是N.inopinata isolate菌的扫描电镜形态图，从图中可以看出，该菌的直径大约为0.2~0.3微米，图b表示的不同时间段内的1mM的铵盐转换为硝酸盐以及其中间产物亚硝酸盐的近化学计量比图。该图是经过了三次重复实验后获得的。

图5、N.inopinata and N.gargensis菌的氨氧化活性的最佳温度。其中图a表示的是N.inopinata菌在不同温度环境下的氨氧化活性研究。图b表示的是N.gargensis菌在不同温度环境下的氨氧化活性研究。从图中可以看出，N.inopinata菌的氨氧化活性最适宜温度是37度，而N.gargensis菌的最佳适宜温度是46度。


Unisense微电极分析系统在研究中发挥的作用：


本论文主要是就微生物的单步硝化和全程氨氧化作用的过程及硝化反应动力学进行了相关研究，研究了硝化螺菌属下属的三种全程氨氧化菌（cmammox）的硝化反应的动力学研究，论文主要是就体系中的总氨的浓度变化来判断微生物菌硝化反应的动力学过程，具体方法是将相关全程氨氧化菌微生物放置于2ml的微呼吸瓶中，同时配合unisense公司开发的氧微呼吸电极，用于检测微呼吸瓶中氧的浓度变化情况，通过氧浓度的变化换算出体系中微呼吸瓶的顶端密封有一个可以添加物质的针头，用于补加胺盐或亚硝盐类物质，这也方便了可以进行不同铵盐的含量对于全程氨氧化菌微生物的硝化性能的影响。微呼吸系统用于微生物的硝化反应动力学的研究是一个很好的研究创新，发挥了微电极分析系统能够实时监测、精度高、相应快的优点，这也首次开拓了unisense微电极分析系统在微生物的硝化动力学的领域研究。


总结


硝化、氨氧化(NH3)形成亚硝酸盐(NO2−）氧化形成硝酸盐(NO3−),这个过程是地球化学氮的生物循环的一个关键过程。单步硝化作用和全程氨氧化微生物的发现终结了传承百年的分布硝化理论，并引发了众多关于全球氮素循环的重要科学问题，如这些微生物在环境中的生态位点及其在硝化作用中的相对贡献等．本论文就几种全程氨氧化细菌的单步硝化作用及其硝化动力学方面展开了相关研究，研究过程中使用了unisense的氧微呼吸，通过监控氨氧化细菌在硝化过程中的氧的消耗来换算出体系中氨的损耗，从而全面解析这类全程氨氧化细菌（comammox）在低营养环境下的完整硝化反应过程及硝化动力学的研究，从整理论文的研究可以看出，正是因为使用了unisense微呼吸研究系统可以全面的检测环境中的氧消耗浓度的变化，从而能够准确的换算出体系中氨的消耗情况，从而能够对这类微生物的硝化反应动力学过程进行研究，该微电极分析系统研究微生物的硝化动力学研究中可以在实验过程中补充铵盐类物质，并且不会影响体系中氧的消耗，这也说明该微电极分析系统在微生物硝化反应动力学过程研究方面存在非常好的应用。