研究简介:Chloroflexus aggregans是Chloroflexota门（以前称为Chloroflexi）的代谢多功能、嗜热、缺氧光养成员，可以光异养、光自养、化能异养和化能自养生长。在温泉相关的微生物垫中，聚集梭菌与含氧蓝藻在动态微环境条件下共存。人们对微碱性、硫化物中房温泉中的微生物垫的微生物多样性和功能进行了深入研究。在63–70°C的水温下，橄榄绿微生物垫以C.aggregans为主，并且未发现产氧蓝细菌。在45–62°C的较低温度下，Chloroflexus spp.与蓝藻共存于深蓝绿色微生物垫（“蓝藻垫”）中。为了阐明C.aggregans的主要生长模式，研究人员研究了中房温泉微生物垫中昼夜循环中能量代谢和CO2固定相关基因的相对转录水平，并与微尺度原位测量相关联O2和光。宏转录组分析表明聚集蛋白具有不同能量代谢模式的两个时期：中午左右的光养作用和清晨的化能作用。当微生物丛处于高氧状态（O2 400–800µmolL−1)时，聚集菌主要采用光异养。


Unisense微电极系统的应用


使用Clark型氧微电极（OX-25；Unisense，奥胡斯，丹麦）原位测量O2浓度随微生物垫深度的变化尖端直径<25µm、搅拌灵敏度低(<1–2%)和快速响应时间(t 90<0.5 s)。O2微传感器安装在电动显微操作器（Unisense，丹麦）上，并连接到PC接口pA计（Unisense，奥胡斯，丹麦），两者均由专用数据采集控制、分析和定位软件（SensorTrace Pro，Unisense，奥胡斯，丹麦）。微操纵器安装在温泉旁边的金属支架上，允许在自然流动、温度和光照条件下将微传感器尖端垂直插入微生物垫中。通过手动操作显微操作器，将微传感器尖端小心地定位在垫子表面（定义为0µm）。随后每15分钟自动记录O2微剖面，持续24小时。在每个剖面中，以步径100µm增量进行O2测量水相并进入生物垫子。对每个深度进行一次测量，并且对于每次测量，应用10秒的等待期，以确保稳定的O2信号，然后记录O2信号在1S时间内的平均值。


实验结果


研究表明聚集菌利用其代谢灵活性以及光养和化能生长的能力，在其自然栖息地（中房温泉微生物垫群落）的不同环境条件下优化其性能。主要的ATP生成时间以及新陈代谢最活跃的时间不仅是中午前后的高光时间（光养性），而且最值得注意的是05:00左右的清晨时间，假设细胞在此时进行化学混合营养生长。利用转录组学方法分析了Nakabusa温泉蓝绿色微生物垫中C.aggregans的原位代谢方式。白天光照是主要的能源来源，支持C.aggregans的光自养、光混合自养和光异养生长，而在下午和夜晚，化学自养生长占主导地位。在下午微好氧低光条件下，化学异养生长基于O2呼吸，而在夜晚，在厌氧条件下进行发酵。令人意外的是，在日出前的清晨，C.aggregans细胞似乎进行以O2为终端电子受体的化学自养生长，这表明C.aggregans细胞在垫的微好氧表层进行垂直迁移。

图1、采样点和以蓝细菌为主的微生物垫的照片。(a)日本中房温泉“溪流遗址”发育的深蓝绿色微生物垫。(b)每个时间点收集的微生物垫核心样品的直径为8毫米，面积约为100毫米，15毫米厚。本研究中使用了岩心样本的上部3毫米。

图2、在昼夜循环中测量的中房温泉以蓝细菌为主的微生物垫中垂直O2浓度分布的热图。从11月3日18:00到18日，在24小时内每隔15分钟测量一次O2浓度（μmol L−1）作为微生物垫深度的函数：11月4日00点。垫子表面用0毫米表示。正深度值表示垫子表面以下的深度，负值表示垫子表面以上的深度，即到温泉上覆水柱的距离。

图3、编码光合反应中心和叶绿体蛋白的基因以及参与细菌叶绿素生物合成的基因的相对转录水平。编码2型反应中心(RC)（pufLMC：Cagg_1639–1640和Cagg_2631）和叶绿体蛋白（csmAMNOPY：Cagg_1222、Cagg_1209、Cagg_1208、Cagg_2486、Cagg_1206和Cagg_1296）的基因平均值由蓝线和橙色线表示。显示了Mg-原卟啉IX单甲酯需氧环化酶（acsF，Cagg_1285，黄线）和厌氧环化酶（bchE，Cagg_0316，绿线）的值。下降光子辐照度（光合有效辐射[PAR]；400–700 nm）以白色表示。星号表示某个时间点颜色对应的特定基因的转录与前一个时间点的转录显着不同。

图4、替代复合物III(ACIII)和金花苷的相对转录水平。光养电子转移的ACIII（Cp、Cagg_3382-3383和3385-3387）和化能电子转移的ACIII（Cr、Cagg_1523-1527）的平均值分别用蓝线和橙色线表示，并带有标准差。编码金花苷的aurA和aurB（Cagg_0327和1833）的值分别显示为黄色（aurA）和绿色（aurB）线。下降光子辐照度（PAR；400–700 nm）以白色表示。星号表示某个时间点颜色对应的特定基因的转录与前一个时间点的转录显著不同。

图5、蓝藻垫中编码3-OHP双循环关键酶和回补途径相关酶的基因的相对转录水平。关键3-OHP酶（即丙二酰辅酶A还原酶(Cagg_1256)和丙酰辅酶A合酶(Cagg_3394)）以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ppc、Cagg_0058和0399）的相对转录水平的平均值由蓝色表示线和橙色线，分别具有标准偏差。下降光子辐照度（PAR；400–700 nm）以白色表示。


结论与展望


氯光菌聚集体（Chloroflexus aggregans）是一种代谢多样性、嗜热、厌氧光营养的叶绿菌门（曾被称为叶绿菌门）成员，可以以光异养、光自养、化学异养和化学自养的方式生长。在温泉相关的微生物垫中，氯光菌聚集体在动态微环境条件下与含氧蓝藻共存。为了阐明氯光菌聚集体的主导生长模式，研究人员研究了Nakabusa温泉微生物垫中与一昼夜周期相关的能量代谢和CO2固定相关基因的相对转录水平，并与O2和光的微尺度原位测量进行了相关性分析。转录组学分析表明，氯光菌聚集体的能量代谢存在两个不同阶段:(1)正午左右的光营养生长和（2）清晨的化学营养生长。在正午时分，当微生物垫富含氧气（400–800µmol L−1 O2）时，氯光菌聚集体主要采用光异养。在清晨时分，相对转录高峰的基因编码摄取氢酶、碳固定的关键酶、呼吸复合物以及TCA循环和乙酸摄取的酶，提示一种好氧的化学混合自养生活方式。这是基于基因转录模式的氯光菌聚集体多样化能量代谢的首次原位研究。在清晨编码摄取氢化酶、碳固定关键酶、呼吸复合物以及TCA循环和乙酸盐摄取酶的基因的相对转录峰值表明有氧化学混合营养生活方式。这是首次基于基因转录模式对聚集蛋白的多功能能量代谢进行原位研究。这些研究结果为这些在动态环境条件下茁壮成长的丝状缺氧光养生物的代谢灵活性提供了新的见解。