由创伤、感染、肿瘤切除和骨科手术中的骨异常引起的临界骨缺损在患者一生中无法自然愈合。尽管骨移植已在临床中广泛用于增强骨再生和修复，但由于新型生物材料的进步，易于制造和广泛使用，骨组织工程（BTE）在治疗大骨缺损方面具有前景。由骨折和疾病引起的大骨缺损是一项重大的临床挑战，通常无法通过身体的修复机制自行愈合。一系列证据表明，缺氧导致骨缺损区域ROS过量产生，对延迟骨再生具有重大影响。研究表明，2%的氧气减少会影响成骨过程中的矿化和碱性磷酸酶(ALP)活性。因此，缺氧会降低骨再生和修复的治疗效果。缺氧除了直接降低细胞活性外，还有利于活性氧（ROS）等促炎介质的增加。然而，短时间内补充过量氧气会导致高氧张力，影响成骨细胞前体细胞的活性。因此合理恢复骨微环境的缺氧状态对于促进骨修复至关重要。在此，研究人员设计了ROS清除和响应性长时间产氧水凝胶（CPP-L/GelMA）作为“骨微环境调节水凝胶”，以逆转骨缺损区域的缺氧微环境。脂质体(CCP-L)和GelMA水凝胶。


在缺氧条件下，CPP-L/GelMA可以释放CAT，降解过氧化氢产生氧气，并被多余的ROS触发，持续释放氧气2周以上。CPP-L/GelMA水凝胶产生的长时间富氧微环境显着增强血管生成和成骨，同时抑制破骨细胞生成。最后，CPP-L/GelMA通过Nrf2-BMAL1-自噬途径在小鼠颅骨缺损模型中表现出优异的骨再生效果。因此，CPP-L/GelMA作为一种调节骨组织呼吸的骨微环境水凝胶，可以有效清除ROS并根据骨缺损区域的需求提供长时间的供氧，具有巨大的临床治疗潜力。


Unisense微电极系统的应用


将15 mL样品管中储存的200μL CPP-L溶液用去离子水稀释至2 mL，然后放入无菌氧气室（O2流量=5 L/min）充氧20 s。然后用氧微电极（OX-NP，Unisense）测量添加2 mL CPP-L溶液前后的水溶液（4 mL）中的氧浓度。Unisense氧气微电极用来实时的检测水溶液中的O 2浓度。与H 2 O 2(10 mM)共孵育后，在不同时间评估CPP-L/GelMA水凝胶(含100μL CPP-L和5%Gelma hygrogel)的催化能力，CPP-L和PFC PLGA/PPS作为对照。然后插入氧微电极（OX-NP，Unisense），实时测量溶液中的O2浓度。


实验结果


开发了一种智能响应释氧水凝胶。CPP-L/GelMA水凝胶作为骨组织呼吸过程中的微环境调节剂，可以递送CAT以酶水解骨缺损微环境中的ROS形成氧气。同时，多余的ROS可以触发水凝胶中载氧纳米粒子表面的PPS发生亲水性变化，释放氧气，从而进一步提高环境要求的供氧量。富氧微环境的形成促进新生血管的形成并抑制破骨细胞的形成。更重要的是，充足的供氧可以提高成骨细胞中BMAL1基因的表达，从而通过增强自噬进一步促进成骨分化，最后显著促进骨再生。

图1、具有清除活性氧和延长产氧作用以增强骨修复的骨微环境调节水凝胶的示意图。(A)将PFC负载到PLGA/PPS纳米颗粒中形成PFC PLGA/PPS纳米颗粒。采用脂质体共负载PFC PLGA/PPS纳米粒子和CAT构建CPP-L，将其进一步封装在GelMA水凝胶中，最终构建CPP-L/GelMA智能响应释氧水凝胶。（B）CPP-L/GelMA可以作为“骨微环境调节水凝胶”来逆转骨缺损区域的缺氧微环境，促进成骨。CPP-L/GelMA植入骨缺损部位后，通过酶水解释放CAT，产生氧气缺氧微环境引起的ROS的产生。此外多余的ROS会触发PFC PLGA/PPS纳米颗粒释放氧气，然后氧气破裂脂质体并分散到周围环境中以进一步供氧。ROS清除和氧气产生通过BMAL1自噬途径促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞形成，并促进新生血管形成，最终加速骨再生。

图2、复合水凝胶的表征。(A)CPP-L/GelMA水凝胶清除ROS和智能供氧的示意图。(B)GelMA水凝胶和CPP-L/GelMA水凝胶的代表性SEM图像。(C)水凝胶的杨氏模量(n=3)。(D)CPP-L/GelMA水凝胶在不同条件下的降解(n=3)。(E)不同条件下CPP-L/GelMA水凝胶中CAT的释放(n=3)。(F)CPP-L/GelMA水凝胶的氧气释放速率(n=3)。(G)不同条件下CPP-L/GelMA水凝胶的氧气释放率(n=3)。比例尺：B中GelMA和低放大倍数CPP-L/GelMA为20μm，B中CPP-L/GelMA高放大倍数为10μm。

图3、CPP-L/GelMA水凝胶对体外成骨细胞和破骨细胞的影响。(A)CPP-L/GelMA水凝胶促进成骨细胞分化同时抑制破骨细胞形成的示意图。(B)用不同制剂处理的MC3T3-E1细胞中ROS荧光染色的代表性图像。(C)ROS荧光染色的定量分析(n=3)。(D)不同处理下MC3T3-E1分化成骨细胞的Col I、OPN、RUNX2、NRF2、HO-1和β-肌动蛋白水平的蛋白质印迹。(E-H)不同处理的MC3T3-E1分化成骨细胞中相对Col I(E)、RUNX2(F)、NRF2(G)和HO-1(H)的定量分析(n=3)。(I)不同处理下MC3T3-E1分化成骨细胞的ALP染色的代表性图像。(J)不同处理下MC3T3-E1分化成骨细胞的茜素红染色的代表性图像。(K)茜素红染色的定量结果(n=3)。(L)不同处理下RAW 246.7分化破骨细胞的TRAP染色的代表性图像。(M)TRAP阳性细胞数量统计(n=3)。比例尺：B、I、J和L为100μm。

图4、CPP-L/GelMA水凝胶可以缓解体内骨缺损部位的缺氧并清除ROS。(A)治疗监测时间线示意图。(B)体内代表性图像注射ROS Brite™700后不同时间点的成像系统。(C)ROS Brite™700的定量分析(n=6)。(D)注射Hypoxyprobe后4周时颅骨缺损区域的代表性荧光图像。(E)Hypoxyprobe染色的定量分析(n=3)。(F)植入的CPP-L或CPP-L/GelMA中的相对残余氧浓度。(G)8周不同治疗后小鼠颅骨缺损区域NRF2的代表性免疫组织化学染色图像（红色箭头指向成骨细胞所在的骨膜）。比例尺：C为200μm，F为50μm。

图5、CPP-L/GelMA水凝胶通过上调BMAL1和自噬促进体内成骨。(A)8周时不同治疗后小鼠颅骨缺损区域的BMAL1、LC3和Col I免疫组织化学染色的代表性图像（红色箭头指向成骨细胞所在的骨膜）。(B)8周时不同治疗后小鼠颅骨缺损区域的BMAL1、Beclin1和OPN免疫荧光染色的代表性图像（黄色箭头指向成骨细胞所在的骨膜）。(C-E)对不同治疗后小鼠颅骨缺损区域的BMAL1(C)、Beclin1(D)和OPN(E)免疫荧光染色进行定量分析(n=3)。(F)颅骨缺损区缺氧微环境中ROS清除和供氧通过激活BMAL1-自噬途径促进成骨再生的示意图体内。比例尺：A中的BMAL1和LC3为50μm，B中的OPN；A中的Col I为200μm；B中的BMAL1和beclin1为20μm。


结论与展望


由骨折和疾病引起的大骨缺损是一项重大的临床挑战，通常无法通过身体的修复机制自行愈合。一系列证据表明，缺氧导致骨缺损区域ROS过量产生，对延迟骨再生具有重大影响。然而，短时间内补充过量氧气会导致高氧张力，影响成骨细胞前体细胞的活性。因此，合理恢复骨微环境的缺氧状态对于促进骨修复至关重要。更重要的是这些材料很难根据受损区域的缺氧程度来加快供氧速率。本研究人员根据骨缺损区域的需求，采用了具有ROS清除潜力和延长供氧潜力的复合水凝胶材料。本研究中，研究人员通过设计了ROS清除和响应性长时间产氧水凝胶（CPP-L/GelMA）作为“骨微环境调节水凝胶”，以逆转骨缺损区域的缺氧微环境。脂质体(CCP-L)和GelMA水凝胶。在缺氧条件下，CPP-L/GelMA可以释放CAT，降解过氧化氢产生氧气，并被多余的ROS触发，持续释放氧气2周以上。CPP-L/GelMA水凝胶产生的长时间富氧微环境显着增强血管生成和成骨，同时抑制破骨细胞生成。最后CPP-L/GelMA通过Nrf2-BMAL1-自噬途径在小鼠颅骨缺损模型中表现出优异的骨再生效果。因此，CPP-L/GelMA作为一种调节骨组织呼吸的骨微环境水凝胶，可以有效清除ROS并根据骨缺损区域的需求提供长时间的供氧，具有巨大的临床治疗潜力。因此，本实验的工程设计的新型供氧CPP-L/GelMA水凝胶有望为临床临界尺寸骨缺损提供新的有效治疗策略。