【摘要】：细胞是生物体结构和功能的基本单元。分析单个细胞内的基因、小分子和蛋白质等，有助于了解细胞的新陈代谢、信号传导等现象，对揭示生命活动规律及肿瘤疾病的早期诊断、预防和治疗具有重要意义。因此，建立简单、灵敏、快速检测单细胞中基因、小分子等物质的检测成为生命分析领域重要的研究课题。目前用于单细胞分析的技术和方法有显微分析及显微操作技术、流式细胞术、荧光分析技术、光镊技术、活细胞探针、数字成像技术及其相关联用技术，并且发展迅速。


一些传统的方法或存在取样体积大、分析时间长及灵敏度低等缺点，难以适用于单细胞的分析，且获取单个细胞中生物分子化学信息的检测方法有限。电化学方法因其设备简单，不需要使用探针对目标进行标记，很大程度上减小了对细胞正常生理机能的扰动。同时，由于收集电化学信号无需受到光学衍射极限的限制，单细胞电化学分析方法不需要以时间分辨率为代价实现高空间分辨率。制备微电极能力以及纳米电化学理论快速发展，显著提高了电化学测量的检测极限、特异性和分辨率。因此，电化学分析方法成为正在迅速发展的单细胞分析方法。本论文的研究目的是制备新型的金微电极电化学生物传感器，建立对TP53基因的检测及亚细胞水平上ATP的波动连续监测的电化学新方法。主要研究内容如下:1.TP53基因是重要的抑癌基因之一。TP53基因检测方法对肿瘤疾病的早期诊断和预后具有重要意义。


本研究了基于金微电极检测TP53基因的电化学传感新方法。首先制备了尖端直径分别为220 nm、120 nm、80 nm的3种金微电极，对微电极进行了电化学方法的表征。后将3′端修饰巯基、5′端标记有电活性物质二茂铁(Fc)的TP53基因捕获探针通过巯基自组装作用固定到金微电极表面，制备了可用于检测目标TP53基因的电化学传感器。当不存在目标TP53基因时，Fc远离电极表面，电流信号较小;当检测到目标TP53基因时，电极上固定的单链TP53基因捕获探针与目标TP53基因杂交形成双链DNA，Fc靠近电极表面，电流信号增大。目标TP53基因的检出限为0.064 nmol/L。利用该传感器对细胞提取液中的目标TP53基因进行了检测，同时对人血清中目标TP53基因进行了加标回收测定。


结果表明，所制备的电化学生物传感器可用于目标TP53基因的检测。2.在亚细胞水平上监测三磷酸腺苷(ATP)的变化对研究细胞能量代谢具有重要意义。然而，传统的ATP检测方法很难提供细胞不同区域ATP水平差异的信息。本研究建立了单细胞内ATP分布和含量的实时分析方法。采用尖端直径为120 nm的金微电极为工作电极，将二茂铁(Fc)标记的ATP适体自组装到电极表面，制备成用于连续监测亚细胞水平上ATP的波动的电化学传感器。在目标物质ATP的存在下，ATP适体与两个ATP结合形成适体-ATP复合物，单链适体DNA折叠形成G-四聚体框架结构，Fc与金微电极距离变小，Fc的电子传递电流增大，基此对ATP进行定量测定，检出限为26μmol/L。并利用该电化学传感器连续监测了饥饿和Ca~(2+)诱导状态下亚细胞水平ATP的波动变化。