三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)是生物体的高能磷酸化合物，还可以作为一种重要的信息递质被释放到细胞外，在神经信息调节、免疫应答、全身炎症、组织损伤与死亡、机体正常发育与体内平衡调控、细胞凋亡与肿瘤细胞清除等生理过程上有重要作用。然而细胞ATP释放机制及调控机理尚不明确，揭示这一机制对于理解发病机制和开发靶向药物治疗至关重要，这也是揭开细胞信号转导之谜的关键，因此实现原位监测细胞ATP释放具有十分重要的意义。基于葡萄糖氧化酶/己糖激酶的电化学ATP生物传感器，因其独有的高灵敏度、快速响应、连续监测、高时间和空间分辨率等特性，已用于离体或在体ATP释放检测。细胞ATP释放浓度低、释放速度快，因此具备高灵敏度、低检测限、快速响应、高选择性、长期稳定性好的高性能电化学ATP生物传感器以及高分辨、快速、动态原位分析系统极其重要。然而现有研究中存在着微电极制备工艺复杂、电极有效面积太小、酶活性不高、长期稳定性差等问题。


针对这些问题，本论文重点从电极结构和性能设计两个方面入手，主要开展了丝网印刷平面电极H2O2传感器研究、丝网印刷平面电极ATP传感器性能优化、铂纳米棒修饰平面微电极阵列ATP传感器研究、3D金-铂纳米花修饰针型微电极ATP传感器研究、细胞ATP受激释放原位监测分析系统及其应用研究，并成功用于高钾溶液诱导PC12细胞ATP释放的原位监测。本论文的主要工作内容和创新如下:


(1)提出一步电化学沉积法固定本征石墨烯纳米片，构建叠层状本征石墨烯-壳聚糖复合膜修饰的丝网印刷平面电极H2O2传感器，检测灵敏度显著增强，线性范围宽，检测限低。采用扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱、拉曼光谱、X射线光电子能谱和电化学循环伏安扫描等分析技术对复合膜进行表征和研究，并优化复合膜制备条件。H2O2传感器是葡萄糖氧化酶/己糖激酶电化学ATP生物传感器的基础，深入探讨H2O2传感器机理，为后续ATP传感器研究奠定基础，且该方法可以推广到其他纳米材料和生物分子的固定化。


(2)实现丝网印刷平面电极ATP传感器，从催化层修饰和酶固定化等方面出发，分别探究了镀铂电压和镀铂时间、戊二醛用量和交联时间、酶层结构和测试环境中Mg2+浓度等因素对传感器灵敏度的影响并做了优化，优化后ATP检测灵敏度可达20.1μA mM-1 cm-2。探索了ATP传感器制备过程中的关键步骤参数，为后续微电极电化学ATP传感器制备提供参考。


(3)设计并加工平面微电极阵列，实现铂纳米棒修饰平面微电极阵列ATP传感器研究，为后续细胞ATP释放监测研究中传感器修饰提供参考。优化金-铂复合结构制备条件并实现可打磨单一超微平面电极ATP传感器。采用光学表征验证不同尺寸微圆盘电极的成功制备。进一步增加电极表面积和提高传感器灵敏度，在微电极上修饰铂纳米棒。铂纳米棒的修饰使传感器灵敏度提高27倍，检测限低至20μM。


(4)提出一种简易微电极封装方法和无模板电沉积层层自组装3D双金属金-铂纳米花结构，构建针型微电极高性能电化学ATP传感器，有望用于后续细胞ATP释放监测研究。采用扫描电子显微镜、能量散射光谱和电化学阻抗分析等对纳米花进行表征，并探究氯金酸浓度和镀金时间对传感器灵敏度的影响。优化后ATP灵敏度为2.28±0.19 nAμM-1 mm-2，线性动态范围为2.5μM～447μM，检测下限为2.5μM(S/N=3)。在4℃的PBS溶液中存储两周后，ATP传感器的葡萄糖灵敏度仍有初始的95.44±6.97%，ATP灵敏度仍有初始的79.39±9.15%。该传感器检测限低、长期稳定性优异和选择性高，源于3D双金属金-铂纳米花出色催化活性和较大电活性表面积有助于保持酶活性和长期稳定性。


(5)设计并实现了细胞ATP受激释放原位监测分析系统，并成功应用于高钾溶液诱导PC12细胞ATP释放的原位监测研究。设计并完成三电极系统、微操纵台及控制器、CCD成像系统和电化学分析仪器的系统集成。从待测细胞选择、刺激源选择、细胞实验细节讨论、细胞实验结果有效性论证及对比实验角度，进一步完善细胞实验。检测到的电流下降幅度约为21.6±3.4 nA(N=6)，对应于ATP浓度为12.2±2.8μM，这一浓度与文献水平一致，均在微摩尔级别。该原位分析系统可用于进一步探究糖酵解和细胞凋亡过程中ATP浓度变化，还可为其他神经递质和细胞分泌物的原位监测研究提供参考。