摘要


将海洋桡足类作为活饲料进行大规模养殖需要为最终用户即孵化场提供可预测且统一的标准产品。对一种以前未描述的大卵型进行了表征，其平均直径为106.5μm，并与连续培养的唐氏无角虫的正常卵（82.3μm）进行了比较。大卵型明显大于正常卵，在大约10万个正常大小的卵中仅发现1个大卵。正常卵和大卵的平均卵密度分别为1.34±0.16 g/cm3和1.20±0.07 g/cm3。从48小时内孵化成功率相对较低（60%）可以看出，大卵处于休眠状态的假设被否定，因为两种卵型之间在卵体积、呼吸速率或绒毛膜组织学分析方面没有发现显着差异。从大卵孵化出的无节幼体相应地较大，桡足类在发育到成年时仍然较大。从大卵孵化出的桡足类是可育的，这一事实表明没有染色体异常，并表明这种卵型代表卵的上尾端，大小与频率呈典型正态分布。下一代的卵子没有它们起源的卵子大，这表明罕见的大卵子代表了母体效应。然而，对于水产养殖中设计大型特定物种的活饲料产品而言，大型鸡蛋确实具有有趣的选择潜力。


1、引言


桡足类被认为是地球上最丰富的多细胞生物（Leandro等人，2006年），具有很高的营养价值，是天然鱼苗的重要食物来源（Højgaard等人，2008年；Støttrup等人，1986年）。这激发了人们将桡足类用作海洋鱼类养殖业的饲料以提高养殖鱼类的存活率和生长率的兴趣（Imsland等人，2006；McEvoy等人，1998；Shields等人，1999）。众所周知，在养殖设施中，浅海石菖蒲桡足类无角亚种的生长相对简单，人们对建立高效、经济、可行的大型无角亚种鱼饲料生产有着浓厚的兴趣（Abate等人，2014；Drillet等人，2011b；Støttrup，2000）。


大规模生产A.tonsa的一个主要挑战是保持高质量鸡蛋的生产率，并确保在需要饲料时获得足够和可预测的孵化成功（Højgaard等人，2008年）。随着季节性和环境物理条件的变化，自然唐沙蜥种群的产卵量、卵类型及其孵化率和成功率有很大差异（陈和马库斯，1997）。在最佳条件下，A.tonsa通常会在产卵后几天内孵化出亚钛质卵（Grice和Marcus，1981）。然而，作为对可预测的年度不利环境条件的反应，a.tonsa倾向于产生滞育卵（Sullivan和McManus，1986），其中胚胎发生处于停滞状态（Dahms，1995）。滞育是一种克服次优自然条件的已知策略（Uye和Fleminger，1976），因为假设滞育受母体调节，并在孵化前经过几个月的不应期（Alekseev等人，2007；Uye，1985）。


亚钛质卵的绒毛膜通常由一层薄的单层卵黄层组成，而滞育卵有一层厚的多层绒毛膜（Castellani和Lucas，2003；Santella和Ianora，1990），在休眠期间保护卵（Coach等人，2001）。A、tonsa还可以产生第三种休眠卵，称为延迟孵化卵（DHE）（Drillet al.，2011a）。这些卵的特点是，与亚钛质卵相比，孵化时间延迟（N48小时），但孵化延迟比滞育卵短，滞育卵在孵化前可以保持数十年的休眠状态（Marcus等人，1994年；Sichlau等人，2011年）。目前，尚不清楚哪些线索导致产生了哪种蛋类型，或者是否同时产生了几种蛋类型。因此，鸡蛋不仅仅是鸡蛋。在水产养殖活饲料大规模生产中，我们的目标是单独生产具有恒定特性、孵化模式和质量的亚钛桡足类卵。可以操纵这些亚钛质卵子进入和离开静止状态，这对于控制储存和将大量卵子运输给最终用户至关重要（Drillet al.，2006）。然而，对桡足类及其卵的特殊吸引特性的探索可能有助于专业产品的开发。


本研究描述并描述了在挪威特隆赫姆渔业和水产养殖SINTEF的大型养殖设施中遇到的一种罕见、大型且以前未描述的蛋型a.tonsa。将这些罕见卵的形态、组织学、密度、代谢、孵化成功率和后代与正常大小的卵进行比较，并对结果进行讨论，以评估这些卵的任何应用作用。


2、方法


向A.tonsa（菌株DFH.AT1）培养罐（1600 L，由SINTEF操作）连续提供昏暗的光线（23°C），并通过自动进料泵（约250 L/d）向对数生长的隐生植物波罗的红单胞菌（约8μm）进料，确保恒定的进料浓度约30000个细胞/毫升（Marcus和Wilcox，2007）。每天（0.9升/分钟）更换培养箱中的总水量，每天采集鸡蛋确保了唐沙酵母种群的稳定。使用120μm（49%开孔面积）、100μm（44%开孔面积）和64μm（45%开孔面积）筛网（SEFAR NITEX）冲洗和浓缩收获的鸡蛋。


将正常大小的卵子从雌性中分离出来，并在10厘米的皮氏培养皿中保存1-2小时，保持培养箱的温度。通过直接从桡足类培养箱底部虹吸收集1-2小时大的罕见鸡蛋，在该培养箱中使用100μm的筛网来冲洗正常大小的鸡蛋和碎片。


在进行任何测量之前，在解剖显微镜下检查采样的鸡蛋，并将其分为正常大小的鸡蛋（~80μm i.d.）和大型鸡蛋（~110μm i.d.）。鸡蛋、无节幼体、桡足类和成虫（见下文）的精确尺寸是使用免费软件“Image J”在固定在光学显微镜上的尼康数字视觉DS-5米彩色摄像机（日本尼康）记录的缩放图像上确定的。为了排除大鸡蛋来自污染培养物的其他龙舌兰物种，我们必须确定其来源。因此，通过分析从大卵孵化的成虫的第5对游泳腿（n=7）来确定物种，这是a.tonsa的一个已知关键特征（Enckell，1980；Mauchline，1998），以确保大卵类型确实来自a.tonsa。


为了确定孵化成功率，用移液管将正常和大鸡蛋分别移入塑料孔（1–2 cm3）中，并孵化48小时（恒定光照、24°C和盐度25）。48小时前孵化的鸡蛋被称为亚皮质醇鸡蛋（Marcus，1979），而活的未孵化鸡蛋（48小时后）被进一步孵化30天（17°C，常氧海水，12:12-h暗-光状态（Drillet al.，2011a），每隔一天将鸡蛋轻轻转移到有新鲜海水的井中，以减少细菌的发育）测定延迟孵化鸡蛋（DHE）或在黑暗中冷却至2°C 30天，并在24°C下重新孵化（Marcus和Fuller，1986；Schneiderman和Williams，1953），测定滞育鸡蛋。


同样的程序也适用于从大型卵型孵化的桡足类（大约10个两性个体）产生的卵（n=105）。2012年10月至2013年10月期间，对A.tonsa卵进行了所有采样和测量。


2.1.纳米呼吸计


耗氧量被认为是整体代谢活动和石菖蒲蛋、胚胎和幼虫表现的最佳指标（Leese，2003；Lopes等人，2005；Marsh等人，1999；Romano等人，1996）。使用定制的Clark型O2微电极，通过商用纳米呼吸计装置（Unisense a/S，Aurhus N，Denmark）测量新采集的单独选择的正常和大型鸡蛋的耗氧率，见Nielsen等人（2007）。


2.2.鸡蛋密度测量


根据在10 cm长的方形毛细管（透明熔融石英，cm-Scientific）中测量的自由落体速度确定两种蛋类型（45个大蛋和49个正常大小蛋）的密度，内径为5×5 mm，大蛋的蛋：管直径比为0.022，正常蛋为0.016，足以排除毛细管壁对下沉鸡蛋的阻力（Happel和Brenner，1965；Huang和Feng，1995）。将毛细管连接到放置在充分混合的恒温水浴（盐度25）中的聚苯乙烯泡沫塑料上。通过连接到蠕动泵的玻璃移液管收集单个鸡蛋，移液管尖端放置在毛细管上。当卵子从玻璃移液管中释放时，使用解剖显微镜观察卵子。如聚苯乙烯泡沫塑料上的标记所示，使用秒表在1厘米的距离上测量稳定下沉率。根据下沉速度，使用斯托克斯定律（已知介质的动态粘度和密度），并使用测量的正常鸡蛋和大鸡蛋直径，计算鸡蛋密度。


2.3.组织学分析


将选定的正常和大鸡蛋加入2%琼脂糖中，然后冷却至5°C 24小时，形成约1 cm3的琼脂糖凝胶块。然后将区块固定在2.5%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.11 M Hepes缓冲液中，并在5°C下储存。然后将鸡蛋嵌入环氧树脂包埋介质（试剂盒45359-1EA-F）中，并在60°C下干燥24小时，然后切出1μM薄片（硅藻组织刀，编号HI 1746，尺寸6）（德国莱卡莫斯克罗系统公司），用甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜（100倍放大）（蔡司Axioskop 2 plus，蔡司公司，德国）中进行分析，该显微镜配有数字瞄准镜DS-5 M彩色摄像机（日本尼康）。


2.4.统计数字


在确定均值和标准差时进行单向方差分析（ANOVA），然后在样本量较小时进行配对t检验（nb 30）。通过检验正常蛋和大蛋耗氧量的方差相等性（f检验），验证了显着差异。在每次数据分析之前，使用α=0.05的显着水平测试正态性。


3、结果


3.1.正常和大型卵的形态特征


对从培养箱中收获的大批量A.tonsa鸡蛋进行调查，发现一些异常大的鸡蛋。在5个单独的日子里，共调查了10批46×106个鸡蛋，共观察到587个异常大的鸡蛋（图1A）。大卵与正常卵的平均±SD比为1:10.3×104±1:5.6×104。在两个队列（图1D和E）的鸡蛋子集上测量正常鸡蛋的准确鸡蛋直径，正常鸡蛋的平均值为82.3±3μm（n=315），大鸡蛋的平均值为106.5±4.6μm（n=119）。这种差异是显着的（图1E和F）。

图1。大而正常的唐氏无刺虫卵（A）（比例尺：100μm），横切面显示正常（B）和大（C）卵的绒毛膜厚度。未经筛分的鸡蛋（D）、100μm筛网筛分的鸡蛋（正常大小的鸡蛋）（E）和100μm筛网保留的鸡蛋（大型鸡蛋）（F）的鸡蛋直径的频率分布。


高分辨率显微镜研究表明，两种卵子类型之间的绒毛膜成分或壁厚没有任何明显差异，呈单层（图1B和C）。这两种卵子都有多刺的外壳，但大卵子的棘更长、更丰富。两种卵子类型均为球形，测量的卵子直径中不包括棘。正常和大型鸡蛋的平均±SD密度分别为1.34±0.16 g/cm3（n=49）和1.20±0.07 g/cm3（n=45）。这些值有显着性差异（ANOVA，p＜0.05）。


3.2.两种鸡蛋的耗氧率


对于这两种卵型，耗氧率逐渐增加，直到孵化时，即产卵后15-17小时。在这一点上，无节幼体游出孵化室，氧气消耗下降到非常低的水平（图2）。我们假设，孵化后留下的有机物质的微生物矿化偶尔会维持室内较低但较高的O2消耗（图2）。


图2。48小时内单个正常和大型鸡蛋的耗氧量曲线。箭头指示孵化点。


大鸡蛋的耗氧率是正常大小鸡蛋的2倍，具有统计学意义（方差分析和t检验，p＜0.05）。在平均±SD下，大卵孵化前2小时的耗氧率为28±12 pmol O2−1个鸡蛋−1小时−1（n=13），而正常大小的卵子的值仅为12±3 pmol O2−1个鸡蛋−1小时−1（n=12）（图3A）。然而，两种鸡蛋类型的平均±SD体积比O2消耗率相似；41.8±9.2和45.04±18.4 nmolO2−1毫米3−1小时−正常鸡蛋和大鸡蛋分别为1（图3B）。


图3。（A）平均±SD胚胎耗氧率（nmolO2−1个鸡蛋−1小时−1）对于正常和大型鸡蛋，孵化前2小时。（B）平均±SD胚胎氧体积比消耗率（nmolO2−1个鸡蛋−1小时−1）对于正常和大型鸡蛋，孵化前2小时。星号表示显着差异。


在所有用于O2测量的鸡蛋中，86%的正常大小的鸡蛋在48小时内孵化，而只有52%的大鸡蛋在同一时间内孵化。显然，在给定的条件下，大卵具有更长的发育阶段（胚胎发生）。然而，对于未用于O2孵化的大型鸡蛋，48小时后孵化成功率分别为91%（n=285）和60%（n=306）。在接下来的48小时内，这两种类型的大多数剩余鸡蛋逐渐解体。没有对这些“老鸡蛋”进行详细调查。