奶牛乳腺炎属于奶牛的一种常见疾病，是制约奶牛健康养殖发展的重要因素，给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。人畜共患的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一。近年来抗生素在养殖业中的滥用加剧了金黄色葡萄球菌耐药菌株的出现和流行，这给奶牛乳腺炎的预防治疗增加了难度和成本，同时病原菌和抗生素对奶产品与环境的污染严重威胁了公共卫生安全。研究金黄色葡萄球菌的耐药机制和环境适应机制对指导抗生素在治疗奶牛乳腺炎中的合理使用、遏制耐药菌株的产生和传播具有重要意义。本试验利用基因编辑技术、细胞培养技术、TEM、q RT-PCR和全基因组测序技术等，对奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌的耐药相关基因进行了检测和功能分析，并且对在本实验中发现的一种新的细菌表型异质亚群进行了表型检测和表型异质产生机制的探究，揭示了金黄色葡萄球菌耐药相关基因与菌群表型异质性对细菌群体抗生素耐药性和环境适应能力的影响。


主要研究结果如下:


(1)奶牛乳腺炎源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)耐药相关基因的检测与分析。以奶牛乳腺炎来源的MRSA菌株BA01611为研究对象，参考实验室前期的BA01611在苯唑西林抗生素处理下的RNA-seq数据，选择了15个表达水平受抗生素影响且在金黄色葡萄球菌中缺乏研究的基因，构建基因敲除质粒，最后成功获得了9株BA01611基因敲除菌株。通过对这9株菌以及实验室前期已构建完成的7株BA01611基因敲除菌株进行抗生素耐药性检测，最终发现了13个与奶牛乳腺炎源MRSA抗生素耐药性相关的基因，包括1个与抗生素抗性成负相关的基因和12个呈正相关的基因，其中有3个基因的敲除严重降低了BA01611菌株的抗生素耐药性，它们分别为:属于Lyt R-Cps A-Psr家族的编码磷酸转移酶的基因lcpA、属于Lys R家族的编码谷氨酸盐合酶转录激活因子的基因glt C和属于Mar R家族的转录调控因子SAV0686。


(2)磷酸转移酶基因lcpA对不同金黄色葡萄球菌抗生素耐药性和细胞黏附等生物学特性影响的研究，以及表型异质菌株Mu50△lcpA-LC的分离。本试验构建了金黄色葡萄球菌菌株Mu50和Newman的lcpA敲除菌株，并从Mu50的lcpA敲除菌株中分离出一种新的耐药性增强且能形成大菌落的表型异质菌株Mu50△lcpA-LC。通过检测细菌抗生素耐药性发现lcpA对抗生素耐药性的影响存在菌株特异性:敲除lcpA显著降低了BA01611和Newman对大部分靶向细胞壁和核糖体抗生素的抗性;敲除lcpA不影响Mu50对多数靶向细胞壁抗生素的抗性，但降低了其对靶向核糖体抗生素的耐药性;敲除lcpA增强了表型异质菌株Mu50△lcpA-LC对靶向细胞壁抗生素的耐药性，但不影响其对靶向核糖体抗生素的耐药性。此外，通过各项检测试验发现lcpA对金黄色葡萄球菌其它生物学特性也具有菌株特异性的影响:对于BA01611，敲除lcpA降低了黏附宿主细胞和菌体抗裂解能力，但增强了生物膜的形成和诱导宿主细胞炎症因子表达的能力，而对其菌黄素合成和菌落扩散没有显著影响;对于Mu50，敲除lcpA对其黏附宿主细胞、菌体抗裂解、菌落扩散和生物膜形成影响不显著，但能降低其菌黄素的合成，增强其诱导宿主细胞炎症因子表达的能力。以上结果表明:lcpA对金黄色葡萄球菌耐药性具有重要作用，但对Mu50具有菌株特异性影响，lcpA对细菌致病性的影响比较复杂;Mu50△lcpA菌株可以通过在细菌群体内产生表型异质亚群Mu50△lcpA-LC来增强群体对抗生素的抵抗能力。


(3)金黄色葡萄球菌表型异质菌株Mu50△lcpA-LC的表型检测及其表型异质产生机制的探究。利用TEM等方法对Mu50△lcpA-LC表型进行全面分析，结果显示:Mu50△lcpA-LC的菌黄素合成水平降低、细胞体积增大，菌落扩散能力增强，生物膜形成能力减弱，在平板上形成表型可逆的淡黄色大菌落。通过与宿主细胞共孵育发现Mu50△lcpA-LC具有更强的宿主细胞黏附能力和刺激宿主细胞免疫因子表达的能力。利用q RT-PCR和全基因组测序等技术对细菌碳源代谢水平进行检测和基因组序列比对分析，发现Mu50△lcpA-LC通过上调acs A等基因的表达水平加速细菌在对数期对乙酸盐的代谢利用，从而下调cid等基因的表达，抑制对数期菌体细胞壁的水解和平台期细胞的裂解，同时，Mu50△lcpA-LC三羧酸循环显著增强，细菌蛋白表达和分泌模式发生显著改变，此外，Mu50△lcpA-LC的编码蛋白A的基因spa表达被激活，这可能帮助细菌逃避机体免疫。Mu50△lcpA-LC碳源代谢水平的变化可能与其表型异质有关。Mu50△lcpA-LC表型异质的发生可能与其碳源代谢水平发生变化有关。


以上结果表明:Mu50△lcpA可以不依赖基因序列的变化和环境改变，在群体内部通过调控碳源代谢产生具有耐药和高扩散能力等表型优势的表型异质亚群Mu50△lcpA-LC，从而增强细菌群体对环境的适应能力。综上所述，本试验在奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌中筛选出了13个的耐药相关基因，全面分析了磷酸转移酶基因lcpA在不同流行菌株中的功能差异，揭示了lcpA功能的菌株特异性。同时，本试验在Mu50△lcpA菌株群体内发现了一种新的耐药表型异质亚群Mu50△lcpA-LC，通过对表型异质亚群的菌群扩散能力、抗生素耐药性和细胞黏附等表型变化的详细阐述，以及对其表型异质产生机制的探究，揭示了菌群内表型异质性对金黄色葡萄球菌应对环境压力的重要作用。本研究丰富了我们对金黄色葡萄球菌环境适应能力的认识，为后续MRSA耐药性研究提供了材料资源和理论基础，为治疗由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎提供理论依据。