摘要


在本研究中，通过控制铜离子（Cu2+）浓度，可以显着减少城市污水生物脱氮过程中氧化亚氮（N2O）的生成。首先，观察到，当在厌氧-好氧（低溶解氧）BNR工艺中处理合成废水时，添加Cu2+（10–100μg/L）可减少54.5–73.2%的N2O生成，并提高总氮去除率。然后，研究了Cu2+的作用。亚硝酸盐和氧化亚氮还原酶的活性随着Cu2+的加入而增加，这加速了亚硝酸盐向一氧化氮（NO2）的生物还原−→NO）和一氧化二氮转化为氮气（N2O→N2）。定量实时聚合酶链反应分析表明，添加Cu2+增加了N2O还原反硝化菌的数量。进一步的研究表明，在添加Cu2+的系统中，更多的聚羟基烷酸酯被用于反硝化。最后，在处理实际城市废水的另外两种BNR工艺中，研究了通过控制Cu2+来减少N2O生成的可行性。由于城市污水中的Cu2+通常低于10μg/L，根据本研究，当BNR系统中的污泥浓度约为3200 mg/L时，将进水Cu2+补充到10–100μg/L有利于减少N2O排放并提高脱氮效果。


介绍


在许多国家，收集和处理的人类废水数量正在增加，以维持和改善饮用水质量，以及其他公共卫生和环境保护效益。全世界都采用了经济高效的生物脱氮（BNR）技术来去除排入当地水道的废水中的营养物。然而，文献数据表明，BNR过程可促进氧化亚氮（N2O）的生成，其变化范围为氮负荷的0%至95%（Foley等人，2010年；Kampschreur等人，2008年；Meyer等人，2005年；Tallec等人，2006年；Zeng等人，2003年）。氧化亚氮（N2O）是一种有效的温室气体，其全球变暖潜力约为同等质量二氧化碳的300倍（Houghton等人，2001年），是过去250年来辐射强迫的第四大贡献者（Stehfest和Bouwman，2006年）。此外，N2O是平流层NOx的主要来源，因此有助于催化臭氧破坏。Ravishankara等人（2009年）发现，N2O的臭氧消耗潜力与氟氯烃相似，预计在整个二十一世纪将保持最大。大气中的N2O浓度从18世纪的约276 ppbv（Machida等人，1995）增加到2005年左右的320 ppbv（美国环境保护局，2011），这被证明是人为原因（Leuenberger和Siegenthaler，1992）。因此，废水处理过程中脱氮除磷过程中N2O的生成不容忽视，需要探索减少N2O生成的途径。


据报道，BNR过程中产生和排放N2O的来源有两种：自养硝化和异养反硝化。（1）硝化作用主要由将铵转化为亚硝酸盐的铵氧化细菌（AOB）和将亚硝酸盐转化为硝酸盐的亚硝酸盐氧化细菌进行。当亚硝酸盐在环境中积累时，AOB可以转变为反硝化，最终产物主要是N2O而不是N2（Philips等人，2002年；Poth和Focht 1985年；Sliekers等人，2005年；Toyoda等人，2011年；Yang等人，2009年）。（2）由于N2O是异养反硝化的中间产物，不完全反硝化可能导致BNR过程中产生N2O（Otte等人，1996；Schalk-Otte等人，2000；Tallec等人，2008）。美国环境保护局（2009年）关于废水处理作业产生的N2O源和汇的最新报告表明，缺氧区的反硝化作用是活性污泥反应器产生N2O的主要来源。还观察到，反硝化过程中的N2O生成量为氮负荷的0.005–95%（Itokawa等人2001；Lemaire等人2006；Meyer等人2005；Tallec等人2008；Zeng等人2003），而硝化过程中的N2O生成量为氮负荷的0–16%（Burgess等人2002；Kampschreur等人2008；Tallec等人2006；Zheng和Hanaki 1994）。


迄今为止，文献中已报告了几种减少BNR中N2O生成的策略，例如增加缺氧时间或空气补充，或应用分步进料序批式反应器（SBR）（胡等人，2011年；Kimochi 1998年；杨等人，2009年）。然而，当采用这些方法时，需要更大的反应堆体积、更大的功耗和额外的控制装置。也有报道称，在间歇曝气活性污泥工艺中添加固定化粪产碱杆菌（反硝化菌）可降低N2O排放。然而，需要培养和制备固定化粪肠球菌（Park等人，2007年）。


众所周知，反硝化途径中N2O的还原是由一种覆铜蛋白——氧化亚氮还原酶（N2OR）催化的。通过低温、高亚硝酸盐、氧气、H2S、低化学需氧量（COD/N）和固体保留时间（SRT）等抑制N2OR活性，将导致N2O累积（Hanaki等人1992；Itokawa等人2001；Mørkved等人2006；Noda等人2003；Otte等人1996；Schonharting等人1998；Zhou等人2008）。Granger和Ward（2003）指出，与铁等其他金属相比，铜是提高纯反硝化菌N2OR活性的重要元素，导致反硝化过程中N2O积累显着减少。Manconi等人（2006）观察到，向反硝化污泥系统中添加铜可以消除H2S对N2OR的抑制作用。虽然铜是影响反硝化的一个已知因素，但铜对BNR工艺中减少N2O生成的影响尚未记录。


本研究的目的是研究在厌氧-好氧（DO浓度0.15–0.5 mg/L）BNR过程中，Cu2+对N2O还原和养分去除的影响。从代谢中间产物、反硝化酶和反硝化菌群落三个方面研究了添加Cu2+减少N2O生成的机理。最后，在另外两种BNR工艺中，研究了通过将Cu2+浓度控制在10–100μg/L来减少城市污水生物处理过程中N2O生成的方法。


材料和方法


合成废水


厌氧-低溶解氧BNR工艺中使用的合成废水每天制备，其中包含（每升）2.5 mL溶液A、2 mL溶液B、1 mL营养液、0.5 mL浓缩蛋白胨液和一定量的乙酸。溶液A含有（每升）10 g MgSO4⋅7H2O，4.5 g CaCl2⋅H2O和93.6 g NH4Cl。溶液B含有（每升）29 g KH2PO4和33 g K2HPO4。浓缩蛋白胨液每升含有200克蛋白胨。营养液中含有（每升）1.5 g FeCl3⋅6H2O，0.15 g H3BO3，0.03 g CuSO4⋅5H2O，0.18克碘化钾，0.12克氯化锰⋅4H2O，0.06 g Na2Mo4⋅2H2O，0.12克硫酸锌⋅7H2O，0.15 g氯化钴⋅6H2O和10 g乙二胺四乙酸。用4 M HCl或4 M NaOH将合成废水的初始pH调节至pH 7.4±0.2。


城市废水


它是从中国上海一污水处理厂的初沉池出口获得的。其主要特征如下：总COD 176–209 mg COD/L，可溶性COD（SCOD）140–170 mg/L，乙酸15–31 mg COD/L，氨（NH4+-N）19–30 mg/L，总氮（TN）28–38 mg/L，可溶性正磷酸盐（SOP）2.8–4.8 mg/L，总磷酸盐（TP）3.0–5.5 mg/L，pH 7.4–7.6。用溶液A和溶液B（如上所述）补充城市废水，得到平均初始NH4+-N和SOP分别为30和12 mg/L。通过添加乙酸，反应器中的初始SCOD保持在约350 mg/L。用4 M HCl或4 M NaOH将城市废水的初始pH值调整为pH 7.4±0.2。


Cu2+悬浮液的制备


本研究中使用了市售铜粉（Sigma），通过配备旋转阳极和Cu-KR辐射源的Rigaku D/Max RB衍射仪进行X射线衍射分析，确认其为纯铜（电子补充材料，图S7）。为了制备1 g/L的Cu2+浆料悬浮液，将1.000 g铜粉（99.9%）分散到20 mL（1+1）硝酸中。将悬浮液加热至铜粉溶解。然后添加10毫升（1+1）硫酸并加热。冷却后，将悬浮液充分混合在970 mL Milli-Q水中。

图1不同Cu2+浓度下需氧阶段N2O排放率（气相）的比较


Cu2+对合成废水厌氧-低溶解氧BNR过程中N2O生成的影响


六个厌氧-好氧序批式反应器（ALDSBR）每天运行三个周期，每个反应器的工作体积为4 L。每个循环8小时（2小时厌氧，3小时需氧，1小时沉淀，10分钟倾析，110分钟空闲）。种子污泥从中国上海市污水处理厂的二沉池中提取。该工厂采用BNR运行。在厌氧阶段的最初10分钟内，将合成废水（2 L）泵入每个反应器。在低溶解氧阶段，使用带在线溶解氧检测器的开/关控制系统间歇性提供空气，以将溶解氧水平保持在0.15至0.5 mg/L之间。在低溶解氧阶段结束前10分钟，浪费污泥，以将SRT维持在约20天。沉淀后，从每个SBR中去除2 L上清液，产生16小时的水力停留时间。除沉淀、倾析和闲置期间外，反应器始终与磁力搅拌器混合。在培养开始时（即从第1天到第20天），这六个SBR中的COD、NH4+-N和SOP浓度分别控制在200、20和8 mg/L，然后从第21天到第40天逐渐增加到350、30和12 mg/L，并最终保持在这些浓度。培养126天后，观察到所有反应器中的氮和磷去除率均未随时间发生显著变化，然后将Cu2+添加到反应器#1#5中，使其浓度分别为10、50、100、1000和5000μg/L。反应器#6作为对照，不添加额外的Cu2+。所有反应器均采用上述相同的厌氧-好氧配置运行。在所有SBR中氮磷去除和N2O生成相对稳定之前需要125天，然后报告数据。


在其他BNR工艺中通过控制城市污水处理过程中的Cu2+浓度来减少N2O生成的检验


运行了三个厌氧-好氧-缺氧SBR（AAA-SBR）和三个多厌氧（缺氧）-好氧SBR（MAAA-SBR），分别通过将Cu2+浓度控制在10和100μg/L来研究减少城市污水生物处理中N2O生成的可行性。从上述ALD-SBR#6中提取种子污泥。这六种SBR中的两种，一种AAA-SBR和一种MAAA-SBR，不添加Cu2+，被设置为对照。所有SBR（每个SBR的工作体积为4.0升）每天运行三个周期（每个8小时）。厌氧-好氧-缺氧过程的每个循环包括2小时厌氧、2小时好氧、1小时缺氧、1小时沉淀、10分钟倾析和110分钟闲置。多厌氧（缺氧）-好氧过程的配置为100分钟厌氧、60分钟需氧、45分钟缺氧、30分钟需氧、45分钟缺氧、30分钟需氧、45分钟缺氧和15分钟需氧周期，然后是70分钟沉降、10分钟倾析和30分钟空闲阶段。沉淀期结束后，排出2.0升上清液，并在接下来的最初10分钟厌氧时间内用2.0升新鲜城市废水进行替换。这六个SBR保持在21±1°C，并通过在最终好氧阶段结束前浪费污泥，将SRT控制在约20天。在活性污泥培养过程中，COD、NH4+和SOP的浓度分别保持在350、30和12 mg/L。直到在所有反应器中观察到稳定的氮和磷去除，才报告数据。


分析方法


COD、NH4+-N、NO3的分析−-N、NO2号−-N、TN、SOP、TP、混合液体悬浮固体（MLSS）和混合液体挥发性悬浮固体（MLVSS）按照标准方法（美国公共卫生协会1998）进行。根据报告的方法测量糖原、聚羟基烷酸盐（PHA）（包括聚羟基戊酸盐、聚羟基丁酸盐（PHB）和聚羟基-2-甲基戊酸盐（PH2MV））（姜等人，2009）。使用微型传感器（丹麦Unisense）测量气相和液相中的N2O浓度，并根据报告的方法计算N2O排放率（Kampschreur等人，2008）。通过消耗电子受体（NO3）来测量硝酸盐、亚硝酸盐、一氧化氮和氧化亚氮还原酶的活性−,NO2号−,NO和N2O），苄基紫精作为合成电子供体（Krijansson和Hollocher 1980）。铜离子通过ICP-MS（安捷伦科技7700系列）检测。


定量实时聚合酶链反应（PCR）如下所示。nosZ基因的引物分别为5′cGcracGcAAsgaaggtsmssgt3′和5′CAKRTG CAKSGCRTGGCAGAA3′，分别称为nosZ2F和nosZ2R（Henry等人，2006）。5′ACCGCCGCCAA CAACTCCAAC3′和5′CCGCTGGCTTGAGC3′，分别称为nirSsh2F和nirSsh4R，被用作nirS基因的引物（Henderson等人，2010）。nirK基因的引物为nirK876和nirK1040，其序列分别为5′atyggggvayggga3′和5′gcctcgatcagrttgt3′（Henry等人，2004）。它们的标准曲线（电子补充材料，图S1、S2和S3）是使用分别含有nosZ、nirS和nirK序列的线性化质粒的10倍连续稀释的三个重复序列作为模板，在上述文献中描述的循环条件下生成的。通过观察单个熔融峰（电子补充材料，图S4、S5和S6）来检查扩增产物的纯度。使用从活性污泥中提取的基因组DNA，使用上述引物扩增nosZ、nirS和nirK基因片段，并在20μL体积中进行实时PCR分析，其中包含1μL 20×SYBR绿色PCR主混合物（SYBR（R）绿色I核酸a，Invitrogen），每个引物0.5μM，和1μL模板DNA。引物的热循环条件符合上述文献。然后，克隆nosZ、nirS和nirK基因片段，并通过测序进行验证。根据提取质粒的浓度和大小（碱基对）计算含有nosZ、nirS和nirK的质粒的拷贝数。分别对活性污泥中的nosZ、nirS和nirK基因进行了独立的定量PCR分析。对每个定量PCR分析运行两个无模板对照。


表1 Cu2+对厌氧-低溶解氧BNR工艺处理的合成废水中N2O生成和NH4+-N、TN和TP去除的影响


结果


Cu2+对厌氧-好氧（低DO）BNR工艺处理合成废水过程中N2O生成和N、P去除的影响


据报道，一些氮被还原为N2O，而不是N2，从而在需氧期产生短暂的N2O累积。图1显示了六个SBR中有氧（低DO）期间N2O排放率的变化。SBR循环期间，生物反应器（#1–#4，#6）的N2O排放呈现出一种规律：N2O的排放速率在需氧期的前2.5小时增加，然后下降。


当Cu2+浓度为10μg/L和100μg/L时，N2O的最高排放速率分别为0.19和0.14μmol/min。与SBR对照（0.45μmol/min）相比，N2O排放率分别降低了58%和68%，表明在低剂量Cu2+添加（10–100μg/L）下，N2O排放量可以显着减少。然而，当Cu2+浓度为5000μg/L时，观察到N2O的释放量较高，这表明Cu2+的剂量超过了适当的限制。在厌氧期间没有检测到N2O生成（数据未显示）。


在本研究中，还测量了液体中的N2O生成量，并量化了总N2O（液相和气相）。如表1所示，未添加Cu2+的反应器（即对照反应器）中的总N2O生成量为0.431 mg N2O-N/mg N。当Cu2+浓度为10μg/L时，N2O的生成量为0.196 mg N2O-N/mg N，当Cu2+浓度为100μg/L时，N2O的生成量进一步降低到0.119 mg N2O-N/mg N。然而，当Cu2+浓度增加到1000μg/L时，生成的N2O变为0.202 mg N2O-N/mg N。与对照组相比，进一步将Cu2+增加到5000μg/L会导致更高的N2O生成量（去除0.520 mg N2O-N/mg N）。因此，与对照相比，通过将废水Cu2+浓度控制在10至100μg/L，可以减少54.4%至72.4%的N2O生成。


表1还显示了Cu2+对NH4+-N、TN和TP去除的影响。当Cu2+浓度在10～100μg/L范围内时，氨氮和总磷的去除率与对照组几乎相同。然而，添加Cu2+对TN的去除有影响。对照组的TN去除率为60.6%，在10μg/L的Cu2+存在下增加到69%（p<0.05）。当Cu2+浓度在10到100μg/L之间时，TN去除率保持在70%左右。从表1还可以看出，NH4+-N和TN的去除率分别显着降低到74.3%和36.3%，当Cu2+浓度增加到5000μg/L时，没有净磷去除。

图2添加100μg/L Cu2+对NH4+-N和NO3变化的影响−-N（a）、硫酸钾和二氧化氮−-N（b）在一个厌氧-低溶解氧循环中。误差条表示三种不同测量的标准偏差