结果


温度和沉积层对沉积物中不同种类微囊藻菌落存活的影响


微电极分析表明，含有微囊藻菌落的表层为需氧层，深层为厌氧层（支持材料中的图S1）。


微囊藻菌落在不同沉积条件下的存活能力如图2所示。通过三因素重复方差分析，分析了温度、微囊藻种类和沉积层对微囊藻菌落存活的影响。温度是显着影响底栖微囊藻菌落存活的唯一因素（P<0.001，表1）。具体而言，25°C的温度对长期存活不利，如相应的事后测试所示。此外，存在显着的温度-层相互作用（P=0.003），表明层间差异取决于所讨论的温度，反之亦然。三次重复的单因素方差分析显示，在15°C（P=0.007）和25°C（P<0.001）时，沉积物深层微囊藻菌落的存活率显着大于表层微囊藻菌落的存活率，而在5°C时，微囊藻菌落的存活率无显着差异（P=0.260）。在5°C时，卫森伯格支原体的存活率显着高于铜绿支原体（P=0.018）。然而，在15°C和25°C时，卫森伯格支原体和铜绿支原体的存活率没有统计学差异（分别为P=0.740和0.981）。



图2不同温度下沉积物表层和深层微囊藻菌落的存活率，表示为存活百分比：5℃下铜绿微囊藻a、5℃下魏森伯格微囊藻b、5℃下微囊藻C、15℃下铜绿微囊藻d、15℃下魏森伯格微囊藻e、15℃下微囊藻f、25℃下铜绿微囊藻g，h M.wesenbergii在25°C下，i.微囊藻在25°C下。根据我们的实验前结果，针对不同的温度设置了不同的采样间隔


如表1所示，时间的处理内效应以及时间与三个因素（温度、微囊藻种类和层数）之间的关系都是显着的，表明沉积物中存活微囊藻细胞的密度随时间而变化。此外，变化模式因微囊藻种类、温度和沉积层而异。因此，通过单因素重复方差分析和Tukey事后检验，分别研究了不同沉积条件下不同微囊藻群的变化规律。


表1重复测量了14周内温度（5、15和25°C）和沉积层（表层和深层）对不同种类微囊藻菌落（铜绿假单胞菌、魏森伯格微囊藻和这两种微囊藻的1:1混合物）存活率影响的方差分析


在5°C温度下，沉积物表层和深层中存活的铜绿假单胞菌的丰度在前18周内没有显着变化，仅在第22周下降（分别为P=0.048和0.044）。在整个实验过程中，表层魏森伯格支原体和微囊藻的丰度没有显着差异（分别P=0.134和0.191）。在深层，在整个实验过程中，细胞数量具有可比性，但卫森伯格支原体在第18周（P=0.020）和混合微囊藻菌落在第10周（P=0.003）除外。当比较初始（第0周）和最终（第22周）细胞密度时，仅发现表层中的铜绿假单胞菌存在显着差异。


在15°C下，在初始滞后期后，表层微囊藻丰度的减少变得相当迅速，此后从第12周到试验期结束，存活率稳定在约25%。铜绿微囊藻的滞后期为4周（第4周与第6周的P值为0.015），而威森伯格微囊藻的滞后期为2周（第4周与第6周的P值为0.013）。在深层，所有三个系列的微囊藻菌落在前8周保持稳定，仅在第8周至第12周（铜绿假单胞菌）或第14周（维森贝格氏微囊藻菌落和混合微囊藻菌落）出现明显损失。随后，未发现显着下降，试验结束时，所有三个系列的微囊藻的存活率均保持在50%以上（铜绿假单胞菌为64.58%，韦森贝基微囊藻为59.22%，混合微囊藻菌落为50.80%）。


在25°C下，所有三个微囊藻系列的动力学表现出相似的趋势。经过2周的滞后期后，表层微囊藻的存活率降至接近零，直到第12周。在深层，5周的滞后期显着延长。铜绿假单胞菌和混合微囊藻菌落的存活率在第14周降至接近零，而卫森伯格假单胞菌的存活率在第12周降至接近零。


底栖微囊藻群体中微囊藻毒素总含量和微囊藻毒素配额的动态


计算并比较了沉积物中微囊藻菌落的总MC含量。MCLR和MC-RR的浓度在所有条件下均表现出良好的相关性（皮尔逊相关性，N=192，R=0.980，P<0.001）（图3）。因此，在本研究中，我们没有将它们分开，而是将它们统称为BMC^。我们比较了三组微囊藻菌落的存活率：毒性铜绿假单胞菌、无毒魏森伯格微囊藻菌落和两种微囊藻的1:1混合物（表示为微囊藻属）。仅分析了铜绿假单胞菌和微囊藻组的MC含量。MC含量的动态表现在两个层面：表层或深层沉积物中所有存活微囊藻菌落的MC总含量和MC配额，其计算方法为总MC含量除以细胞计数的商。微囊藻群的MC配额可能受到铜绿假单胞菌和威森伯格假单胞菌丰度比的影响。因此，仅使用铜绿假单胞菌的MC配额来反映每个细胞间MC含量的变化（图4）。

图3 5°C下铜绿假单胞菌a和微囊藻PP沉积物表层和深层微囊藻菌落中MC-RR总含量的动态。在5°C下，铜绿假单胞菌在15°C下，d微囊藻PP。在15°C下，铜绿假单胞菌在25°C下，微囊藻属在25°C下。根据我们的实验前结果，针对不同的温度设置了不同的采样间隔

图4 5°C（a）、15°C（b）和25°C（C）条件下沉积物表层和深层中铜绿假单胞菌的微囊藻毒素配额。根据我们的实验前结果，针对不同的温度设置了不同的采样间隔


温度和沉积层显着影响沉积物中微囊藻菌落的总MC含量（表2）。在较低温度下，微囊藻菌落的总MC含量在深层显着较高。此外，存在显着的温度-层相互作用（P=0.003），表明层间差异因温度而异。


表2重复测量温度（5、15和25°C）和沉积层（表层和深层）对微囊藻菌落（铜绿假单胞菌、1:1的铜绿假单胞菌和韦森伯格假单胞菌混合物）MC-RR总含量影响的方差分析

在不同温度下分别进行单向重复方差分析和Tukey的事后检验。在5°C下，整个试验期间，铜绿微囊藻和混合微囊藻菌落中的MC总含量没有显着差异（表层铜绿微囊藻，P=0.062；表层微囊藻属，P=0.065；深层铜绿微囊藻，P=0.137；深层微囊藻属，P=0.087）。通过两两比较，第22周表层菌落的总MC含量显着低于其他采样日期。在15°C和25°C时，铜绿假单胞菌中的总MC含量在实验期间显着下降（P<0.05）。在15°C的深层，铜绿假单胞菌和微囊藻菌落的总MC含量在前8周保持稳定（铜绿假单胞菌，P=0.167；微囊藻，P=0.088），并从第10周到实验结束显着下降。在15°C的表层中，MC的总含量在第二周或第四周开始显着降低，在其余的实验期间，这种降低趋势持续。在25°C时，铜绿假单胞菌和微囊藻菌落的总MC浓度在前5周迅速下降，随后在表层和深层均保持较低水平。表层铜绿假单胞菌细胞中MC浓度显着低于深层铜绿假单胞菌（P<0.001）。


温度和沉积层显着影响绿脓杆菌的MC配额（P<0.001，表3）。在较高温度（25°C）和表层，铜绿假单胞菌的微囊藻毒素配额显着降低。时间的内处理效应，以及时间与温度和层之间的关系都是显着的。


表3重复测量了14周内温度（5、15和25°C）和沉积层（表层和深层）对铜绿假单胞菌微囊藻毒素配额影响的方差分析


对每个温度进行单因素方差分析和Tukey的事后检验。与三因素方差分析的统计结果不同，根据单因素方差分析（5°C，P=0.062；15°C，P=0.449；和25°C，P=0.371），两层沉积物中铜绿假单胞菌的MC配额之间未发现显着差异。在5°C时，第一周铜绿假单胞菌的MC配额与第6、第10和第22周的MC配额相当，但显着低于或高于第2、第14和第18周的MC配额。在15°C时，只有第2周和第14周的MC配额与初始值显着不同。在5°C和15°C下采集的样品中，铜绿假单胞菌的MC配额没有显着差异。虽然在一些采样日期存在波动，但微囊藻毒素配额在5°C和15°C下在表层和深层沉积物中基本稳定。在25°C下，任何采样日期的MC配额都明显低于实验开始时。


沉积物中微囊藻群体光合活性的动态


使用三因素重复方差分析测试分析温度、微囊藻种类和层数对微囊藻菌落Fv/Fm的影响（图5）。温度和沉积层显着影响底栖微囊藻菌落的Fv/Fm（P<0.01，表4）。在所有沉积条件下，微囊藻的Fv/Fm逐渐降低，在较高温度（P<0.001）和表层（P=0.002）下，Fv/Fm的下降百分比增加。毒性铜绿假单胞菌和无毒韦森伯格假单胞菌的Fv/Fm无显着差异（P=0.320）。


图5不同温度下沉积物表层和深层微囊藻的有效量子产率（单位：PSII（Fv/Fm））。铜绿假单胞菌在5°C时，铜绿假单胞菌在5°C时，铜绿假单胞菌在5°C时，铜绿假单胞菌在15°C时，铜绿假单胞菌在15°C时，铜绿假单胞菌在15°C时，铜绿假单胞菌在25°C时，铜绿假单胞菌在25°C时，铜绿假单胞菌在15°C时，铜绿假单胞菌在15°C时，铜绿假单胞菌在15°C时，铜绿假单胞菌在25°C时，铜绿假单胞菌在25°C时，铜绿假单胞菌在25°C时，铜，根据我们的预实验结果


表4重复测量了14周内温度（5、15和25°C）和沉积层（表层和深层）对绿脓杆菌光合活性影响的方差分析


治疗时间内的疗效显着。微囊藻菌落的丰度开始下降之前有一段滞后期。然而，在整个实验过程中，Fv/Fm值显着降低。时间与三个因素（温度、微囊藻种类和层）之间的关系显着，表明下降速度受微囊藻种类、温度和沉积层的影响。


讨论


在这项研究中，我们考察了在受控实验室条件下，考虑温度和氧气的影响，底栖微囊藻菌落的存活能力。我们不打算在不同温度下模拟底栖微囊藻群落的整个寿命，因为浅水湖泊中沉积物的温度是周期性的，并随季节变化。相反，我们采用了为期4-6个月的模拟试验来评估底泥中微囊藻菌落的存活能力。


在5°C条件下，表层和深层沉积物中的微囊藻菌落丰度在实验结束时（第22周）没有显着减少，表层中的铜绿假单胞菌除外。在15°C和25°C时，沉积物中微囊藻菌落的丰度在初始滞后期后迅速下降，随后存活率稳定下来，直到实验结束。物流模型（方程式1）大致符合沉积物中微囊藻菌落在15°C和25°C下存活百分比的动态：


其中t、y、t0和p分别代表采样时间、沉积物中微囊藻的存活百分比、中心时间和功率。A1和A2代表存活率稳定的初始值和最终值。通过对模型进行一阶导数，得到了变化过程的开始时间和结束时间，分别用t1和t2表示。也就是说，微囊藻细胞的存活率在t1的初始滞后期后开始下降，此后存活率从t2到试验期结束稳定在A2（表5）。


表5根据逻辑模型计算的15或25°C条件下不同沉积物层中微囊藻菌落的存活百分比


较大的初始延迟时间（t1）和最终存活率（A2）可以反映较高的存活率。由于在5°C下22周的实验过程中几乎没有发现任何显着的下降，t1和A2可分别被视为22周和100%。通过比较不同条件下微囊藻菌落的t1和A2，我们得出以下结论：（1）低温有利于微囊藻菌落在沉积物中更长的存活时间，（2）铜绿假单胞菌的最终存活百分比（表5中的A2）在15℃和25℃时高于卫森伯格微囊藻，深层微囊藻的存活率显着高于表层微囊藻。微囊藻菌落的存活能力可与植物种子的存活能力相比较，植物种子埋在土壤中时，可作为下一季萌发的种子库；硬壳种子可以在土壤中存活数十年，同时在适当条件下保持发芽能力。因此，沉积微囊藻菌落也可以被认为是一种种子库；在野外条件下，微囊藻形成由数十个、数百个或数千个细胞组成的菌落，细胞被厚厚的鞘覆盖。就像种子的外壳一样，微囊藻菌落的鞘可以保护微囊藻细胞免受不利的底栖条件的影响。低温和厌氧条件促进了种子和底栖微囊藻群体的长期存活（Andrade，2001年）。


温度是影响沉积物中微囊藻菌落存活的最重要因素。在5°C温度下22周的实验过程中，微囊藻数量几乎没有显着减少，而在25°C温度下，超过90%的底栖生物种群在3个月内消失。这些结果与现场调查结果一致。例如，微囊藻菌落可以在格兰根特湖（法国）的沉积物中存活长达6年，那里的温度总是低于10℃（Misson等人，2012a）。在德国Quitzdorf水库的另一个湖泊的沉积物中，当温度在再侵入阶段持续高于12°C时，65%到85%的底栖微囊藻群落死亡（Ihle等人，2005年）。本研究定量揭示了沉积物中微囊藻菌落的存活情况。根据我们的研究结果和亚热带浅水湖泊温度的实际季节变化，大多数底栖微囊藻群落能够成功越冬，因此有可能在第二年春天接种水柱，但它们不能在亚热带浅水湖泊的沉积物中积累多年。


氧气水平是决定底栖微囊藻菌落存活的另一个因素。微囊藻菌落在好氧表层沉积物中的存活率显着低于厌氧深层沉积物。如表1所示，在15°C下放置17周后，上层沉积物中微囊藻菌落的丰度下降，存活率低于20%，而深层沉积物中的种群减少率低于50%。其他研究人员也报告说，沉积物表层中有更高比例的微囊藻菌落消失（Brunberg和Blomqvist，2002年；Ihle等人，2005年），这可能是再侵入和细胞溶解的结果。其他蓝藻，如圆柱状振荡藻，也对氧敏感，在还原条件下比有氧条件下存活更长（Richardson和Castenholz 1987）。


毒性铜绿假单胞菌和无毒维森伯格假单胞菌具有相似的存活能力，尽管铜绿假单胞菌在15°C和25°C下的最终存活效率（表5中的A2）高于维森伯格假单胞菌。一些研究人员发现，MCs可能参与了底栖微囊藻的存活机制。因此，有毒微囊藻菌落可能比无毒菌落更容易越冬（Ihle等人，2005年；Misson等人，2012a）。然而，在我们的研究中，毒性铜绿假单胞菌和无毒维森伯格假单胞菌的存活率没有显着差异。覆盖鞘的厚度可能是影响微囊藻生存能力的关键因素。在沉积物中，有鞘光养生物比无鞘光养生物寿命更长（Jørgensen等人，1988年）。铜绿假单胞菌的鞘比维森伯格假单胞菌的鞘薄得多。因此，有毒铜绿假单胞菌中的MC可能有利于其长期存活。然而，这一优势可能被铜绿假单胞菌较薄的鞘层所抵消。在另一项研究中，在沉淀物中埋藏6年和33年的底栖微囊藻种群之间，未发现有毒和无毒细胞比例的显着差异（Rinta Kanto等人，2009年）。需要进一步的研究来揭示细胞内MC在底栖微囊藻菌落存活中的生理作用。


在5℃和15℃下，微囊藻细胞中的MC含量在实验期间基本保持稳定。因此，可以推断，在黑暗条件下，沉积物中不会产生MCs。此外，底栖微囊藻保存的MCs没有作为碳源消耗或释放到周围环境中。然而，在25°C时，微囊藻细胞的MC配额显着降低。在此温度下，微囊藻细胞的光合活性显着降低。微囊藻细胞膜也可能受损，细胞间MC可能从细胞中释放，导致MC配额下降。Wu等人（2015年）还发现，新鲜蓝藻样本中的细胞内MC在细胞破裂之前不会迅速减少。对于野生样本，微囊藻种群包括有毒和无毒两种形式。因此，现场样本中MC配额的波动可能主要取决于有毒和无毒细胞的相对比例，而不是有毒细胞的细胞内MC含量水平。在我们的研究中，定量测定了群体微囊藻菌株纯培养物中细胞内MC的动态，从而消除了群落组成的任何潜在影响，并提供了更具针对性的结果。底栖微囊藻群体的光合活性逐渐下降，在较高温度下下降幅度较大。我们的研究结果和其他研究结果表明，在没有光照的情况下，沉积物中PSII的光化学效率逐渐降低（Schöne等人，2010）。当温度低于15°C时，毒性细胞和无毒细胞的存活率没有显着差异，细胞内含量稳定。因此，在越冬和再入侵期间，底栖微囊藻种群的毒性没有显着变化。


结论


在这项研究中，我们系统地研究了微囊藻菌落在表层和深层沉积物中，在不同季节对应的不同温度下的存活能力。低温和厌氧条件促进了底栖微囊藻菌落的长期存活。毒性铜绿假单胞菌和无毒魏森伯格假单胞菌表现出相似的存活能力，在实验期间，底栖微囊藻细胞的MC含量在5℃和15℃下保持稳定。因此，在越冬和再入侵期间，底栖微囊藻种群的毒性没有显着变化。我们的研究表明，大多数底栖微囊藻群体能够成功越冬，微囊藻毒素得以保存，光合活性得以维持，显着增加了水华形成的风险。因此，需要采取疏浚或覆盖沉积物等人工措施，以避免沉积物中累积微囊藻菌落的不利影响。在夏季，当亚热带浅水湖泊的温度较高（例如25°C）时，底栖生物种群的存活率在3个月内降至接近零。因此，底栖微囊藻种群不能在亚热带浅水湖泊的沉积物中积累多年。


致谢


中国国家自然科学基金（31270509和31370504）、中国水污染防治与治理重大科学技术计划（2013ZX07102005）、国家淡水生态与生物技术国家重点实验室（2016FB10）等国家科学基金资助项目（41561144008和）。作者感谢有害藻类团队的所有成员，特别是中国科学院水生生物研究所的李仁辉教授，感谢他们对微囊藻菌株的纯培养和仪器的帮助。我们还要对袁晓博士（中国科学院水生生物研究所分析测试中心）的仪器支持表示最深切的感谢。