摘要


据报道，昆虫肠道微环境中的物理化学条件在食物加工和代谢中起着重要作用。在这项研究中，用微电极系统研究了真菌生长白蚁——台湾白蚁的离体肠道中的氧、pH、氧化还原电位和氢的分布。与其他白蚁相比，台湾白蚁肠道系统的氧分压相对较低，范围为0至8.6 kPa。除直肠区域外，不同肠道区域的pH值为中性（pH值6.1–7.4）。每个肠道区域（直肠除外）中心的平均氧化还原电位较高，范围约为+70至+310 mV。特别是，作为木质纤维素降解过程中的中心中间体，后肠腹中的氢分压高达10.4 kPa。此外，使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）评估了白蚁肠道系统、巢穴共生真菌梳以及巢穴土壤样本中的13种金属离子浓度，这表明，在主要消化道区域记录的13种离子中，有6种金属离子（K、Mg、Mn、Ba、Se和Mo）在空间分布上存在显着差异。在直肠、真菌梳子和巢穴土壤样本中也观察到一些金属离子显着富集。较低的氧气浓度、中性pH值、较高的氧化还原电位和较高的氢积累，以及台湾褐飞虱消化道中金属离子的特征性空间分布，突出了真菌生长白蚁在其肠道微环境中最重要的独特性，提示肠道生态系统的独特结构和功能可能存在于肠道内。


1.介绍


许多昆虫肠道系统的物理化学条件已在文献中得到充分记录（Gross等人，2008年；Johnson和Barbehenn，2000年；Lemke等人，2003年）。还报告了一些关于食木白蚁和食土白蚁肠道分隔系统的独特研究，并对其氧、氢、pH和氧化还原电位的轴向和径向动态进行了原位表征（Brune等人，1995a；Ebert和Brune，1997；Kappler和Brune，2002）。根据所报道的这些物理化学参数，我们提出了一些基本代谢过程的机制以及白蚁肠道中的食物消化，并将其应用于进一步了解食物消化，肠道共生微生物结构及其在这些白蚁肠道环境中的相应功能（Brune等人，1995b；Kappler和Brune，1999；Pester和Brune，2007；Schmitt Wagner和Brune，1999）。这些研究确实有助于深入了解肠道物理化学环境及其在肠道代谢中的关键功能之间的关系，如木材消化过程（Ke等人，2010）。


此外，肠道系统中的金属离子对取食木材的昆虫可能很重要，这不仅是因为已经进化出多种酶，需要与某些金属结合，以便它们的催化活性在许多生物过程中发挥关键作用，例如白蚁的产氢、呼吸和碳水化合物水解，但也涉及肠道微生物群中碳和电子流动的途径（Vu等人，2004年；Ballo和Leadbetter，2011年）。白蚁肠道系统中的几种木质纤维素酶已被证明是金属依赖性酶，包括食木白蚁黄鳍网纹白蚁前肠中的铜结合漆酶（Coy等人，2010年），以及真菌生长白蚁安南代大白蚁后肠中的镁依赖性木聚糖酶（Liu等人，2011年）。因此，更好地描述肠道微环境中的金属离子分布可能有助于了解白蚁如何利用各种生物催化剂有效消化肠道系统中的木材基质，以及有助于为未培养的肠道微生物群设计更有效的培养基的潜在价值。


然而，迄今为止，关于真菌生长白蚁肠道内的物理化学条件和金属离子分布的信息仍然有限且罕见。作为高等白蚁的一个单系谱系（它们的后肠通常没有原生共生体，Bignell和Eggleton，1995年），真菌生长的白蚁通常在热带和亚热带地区大量存在，尤其是在亚洲和非洲，数百万年来，它们一直是地球上木质纤维素循环利用中最重要的分解者之一（Nobre et al.，2011）。这种以木材为食的白蚁可以在其巢穴中独特地培养一种共生真菌，即白蚁菌属（Aanen，2006），它有效地帮助白蚁宿主降解难降解的木质纤维材料，尤其是木质素对应物，同时也提高了它们肠道中全纤维素的消化率（Hyodo等人，2000年；Zhou等人，2010年）。因此，与其他类型的白蚁不同，这些真菌生长的白蚁呈现出一种独特的消化系统，与各种微生物共生体相关，从它们的肠道系统，也从它们的巢穴。由于这种特殊的联系，真菌生长白蚁的肠道系统具有独特的形态结构，与其他高等白蚁不同。混合段的缺乏和拉长且高度分隔的后肠表明，它们可能同时发展出不同的物理化学环境，以应对食物加工和相关代谢（Anklin-Mühlemann等人，1995年）。因此，了解真菌生长白蚁的肠道理化条件和相关的金属离子分布对于它们高效的食物消化功能非常重要。


目前，对真菌生长白蚁肠道pH值和氧化还原电位的大多数研究都是通过收集主要肠道段的样本和使用pH敏感纸进行观察来进行的（Anklin-Mühlemann等人，1995年；Bignell和Eggleton，1995年）。然而，通过这种方法获得的数据可能无法代表真菌生长白蚁的分化肠道系统的实际原位微环境，因此无法预测可能的食品加工模式（Brune和Kühl，1996；Ke等人，2010）。


在这项研究中，微电极技术被用于测量真菌生长白蚁物种台湾白蚁的肠道主要隔室的轴向和径向pH、氧、氧化还原电位和氢。此外，还使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定了肠道系统不同区域内的金属离子分布。


2.材料和方法


2.1.昆虫


2011年7月，在中华人民共和国浙江省诸暨市的田野中收集了一窝含有活性白蚁和真菌梳的台湾白蚁。在实验室中，在25±1℃和>69%相对湿度的恒定温度下，在完全黑暗的环境中使用前，菌落保持不超过一周。从群体中随机选择工蚁，并用于所有测量。图1显示了台湾白蚁工蚁的独特形态以及隔离肠道中的主要隔室。

图1。 台湾白蚁工蚁离体肠道系统的形态特征。 图中显示的主要肠道腔室包括前肠（FG）、中肠（MG）、大腹便便（Pa）、结肠（Co）和直肠（Re），其中大腹便便、结肠以及直肠被归类为白蚁消化道系统中的后肠。


2.2.微电极


氧微传感器（OX-25）和氧化还原电位电极（RD-25）的尖端直径约为25 lm。氢微传感器（H2-10）的尖端直径约为10 lm，pH电极（pH-10）的尖端直径为10-20 lm，敏感尖端长度为100-150 lm。在pH和氧化还原电位测量期间，使用Ag-AgCl参比电极（REF-25），并通过填充KCl的琼脂糖桥铸入PTFE管连接到测量室（Brune和Kühl，1996）。本实验中使用的所有微传感器及相关放大器均从Unisense（丹麦奥胡斯）购买。


在使用该系统测量氧气之前，将氧气电极预极化至少2小时，并用抗坏血酸钠溶液（0.1 M最终浓度）和起泡的Milli-Q水（>5分钟起泡）校准。用邻苯二甲酸氢钾缓冲液和硼酸盐缓冲液（pH分别为4和9）校准pH电极。用氢醌氧化还原缓冲溶液（每升缓冲溶液中10克氢醌，pH值4或7）校准氧化还原电极。最后，将氢电极预极化至少1小时，直到传感器信号稳定，然后用Milli-Q水和用氢气冲洗的Milli-Q水进行校准（>5分钟起泡）。上述所有化学品均从国药集团化学试剂中国（中国上海）订购。


2.3.微电极测量


对于氧气、pH值、氧化还原电位和氢气测量，按照Brune等人（1995a）的描述，用一个微载玻片和四个微盖玻片制作了一个微室。将一层4–5 mm厚的琼脂糖（由昆虫林格溶液中的1.5%琼脂糖组成）填充到每个微室中。在琼脂糖层表面以拉长和拉伸的方式分离完整的台湾白蚁工蚁肠道，然后在测量之前在肠道样本上快速涂上一薄层琼脂糖（40℃）。


使用手动微操作器（丹麦奥胡斯Unisense）定位微传感器，使用水平安装的显微镜（中国江南）目视控制尖端位置和肠道位置，琼脂糖在载玻片上凝固后，立即用微电极系统对白蚁肠道进行测量。在25±1℃的常规空调条件下，用微电极的外端在台湾褐飞虱肠道系统的五个主要腔室（包括前肠、中肠、腹部、结肠和直肠）的不同点从肠壁开始测量动作。


2.4.金属离子分析


随机抽取10只台湾白蚁，分别解剖出每一个肠道系统。用Milli-Q水分别冲洗每个白蚁工人肠道系统中的前肠、中肠、大腹便便/结肠和直肠内容物，并立即将其转移到1.5 ml灭菌管中，其中含有500 ll Milli-Q水。此后，在80℃下用5mL HNO3消化每个肠道部分的洗涤内容物管1小时，然后在160℃下在块状加热器中蒸发1.5小时，去除HNO3。最后，蒸发后约0.5 ml的消化样品在分析前用10 ml Milli-Q水稀释。


从台湾白蚁巢穴采集的土壤样本和真菌梳经风干后磨成细粉（<2mm）。接地的土壤和梳状样品（0.2 g）在120℃下用微波3000（Anton Paar，奥地利）和6 ml HNO3进一步进行微波消解10 min，然后在190℃下进行20 min，然后在160℃下转移到块状加热器中超过1 h，直到溶液变为无色，旨在去除样品中的HNO3和潜在有机物含量。在分析之前，用20 ml Milli-Q水稀释剩余的消化样品（约1 ml）。


通过ICP-MS（安捷伦7500A）和八极反应系统（ORS）（日本横河分析系统公司）分析从每个隔间的白蚁肠道系统或共生真菌梳制备的消化样品，以及白蚁巢穴的土壤中的金属离子分布。ICPMS测量的每个样品的剖面总共包括13种不同的金属离子（K、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn、Ni、Al、Ba、Se、Mo、Ca和Na），因为在白蚁肠道系统和它们巢穴中的共生真菌中，参与木质纤维素消化和肠道必需代谢的一些相关酶，可能与这些金属离子有关。所有校准标准溶液均通过在2%（v/v）HNO3中适当稀释1000 mg/L多元素标准储备溶液（安捷伦，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）制备。此外，从安捷伦（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托安捷伦）购买的10 lg/L铟用作内标，并添加到所有样品、标准品和空白中。ICP-MS的工作条件如下：射频功率1250W；等离子体气体流速，15升/分钟；载气流速，1.06升/分钟；雾化器泵，0.1转/秒。


为了计算不同肠道隔室中的金属离子浓度，根据其几何形状估计肠道部分（前肠、中肠、大肚结肠和直肠）的体积（Anklin-Mühlemann等人，1995年）。因此，每个肠道部分的金属离子浓度最终报告为单位体积内金属离子相对于肠道部分的摩尔重量（mM）。另一方面，巢穴真菌梳和土壤样本的金属浓度报告为单位水体积中金属离子的摩尔重量，单位样品重量（mM）。本次调查中的每项测量和观察重复四次。


2.5.统计分析采用单因素方差分析和Bonferroni多重比较试验（a=0.05），对台湾褐飞虱肠道室效应和肠道室（前肠、中肠、腹部/结肠）中检测到的金属浓度的差异进行分析。积聚在白蚁肠道系统直肠区域的金属离子将主要排出，随后作为外共生真菌梳子的基质。因此，大多数积聚在直肠中的金属离子与真菌梳子以及白蚁巢穴中的土壤样品中的金属轮廓显着正相关。因此，将直肠的数据与巢穴真菌梳子和土壤样本的数据进行分组，以进行金属离子富集效应的方差分析。使用软件R版本2.13.0（www.R-project.org）进行所有数据分析。