3.结果


3.1.添加SPC后，微环境发生了变化


为了研究添加SPC对微环境的瞬时影响，在添加SPC剂量后3小时，测试环境变量，包括pH、ORP和溶解物质。图1a显示硫酸盐、碳酸盐、DOC和pH的量随着SPC剂量的增加而增加，且增量与SPC剂量呈线性相关。相反，ORP降低，ORP降低与SPC剂量呈线性相关。

图1。加入SPC后，环境变量发生变化。（a）SPC剂量与环境变量增减的关系；（beh）随着SPC剂量的不同，环境变量在不同时期发生变化（基于邓肯检验，采用SPSS中的双向方差分析对显着差异进行检验；大写字母表示不同时期一种治疗的差异，小写字母表示同一时期不同治疗之间的差异，n¼3，a¼0.05）。


基于这些结果，对于以下结果，使用对照（C）、低（L）、中（M）和高（H）微宇宙来表示空白对照和三剂量SPC（11.2，22.4，和33.6毫摩尔SPC G-1湿沉积物）。图1b-h显示加入SPC后微观环境变量的趋势不同。首先，pH值在第15天下降，之后保持稳定。第二，ORP在第15天下降，之后缓慢上升。第三，碳酸盐和DOC在第15天增加，但在第37天显着减少，之后保持稳定。此外，在使用SPC处理的所有微观世界中，磷酸盐在第15天显着增加，而在L水平处理中减少，在第37天M和H微观世界中增加。然而，添加SPC后的硫酸盐在第15天降至C微观结构的水平，在第50天降至C微观结构的值以下；在第15天，L、M和H微观结构中的铵含量超过了C微观结构中的铵含量。


3.2.添加SPC后微生物群落的潜在代谢活性


图2a显示了Biolog生态板的AWCD，用于描述本地微生物群落的潜在代谢活动。在第0天和第15天，四种处理的AWCD曲线显示出相似的模式，L、M和H微观世界的值超过了C微观世界的值。在第37天和第50天，AWCD曲线的模式发生变化，在M和H微观世界中呈现“S”形。

图2。在不同时期（n¼3），对照和SPC处理中所有六组碳源（b）的AWCD曲线（a）和潜在活性（b）。


此外，ECO板的31个碳源分为六组（Pan等人，2015），包括两种胺/酰胺、六种氨基酸、七种碳水化合物、九种羧酸、四种聚合物和三种其他碳源。图2b显示了ECO板在84 h时所有六种类别的平均吸光度。显然，在羧酸和聚合物基团中，SPC处理和C基团之间未发现显着差异；然而，其他四组在不同时期存在差异。在碳水化合物组中，M和H微观结构的平均吸光度显着增加。此外，杂类组在第0天和第15天在M微观世界中显着增加，在第15天在H微观世界中显着增加。氨基酸组仅在第37天M微观世界中显着增加。相反，在胺/酰胺组中，H微观世界的平均吸光度在第37天显着降低，M微观世界在第50天显着降低。


3.3.添加SPC后本地微生物群落的分类组成和功能群


根据ANOSIM、ADONIS和MRPP分析（表S2），在每个时期观察到所有样本的显着差异（R>0、R2>0、d>0，均p<0.01）。表1总结了C和SPC处理的微生物群落的α多样性。Shannon指数和Simpson指数表明C、L和M微观世界之间没有显着差异，而H微观世界中的差异显着。在第15、37和50天，H微观世界中的潮-1和均匀度显着降低；然而，在L微观世界中，这些指数仅在第15天显着降低。此外，NMDS结果显示H水平处理与其他处理之间存在明显的距离（图3A）。


表1不同时期对照和SPC处理微生物群落的α多样性分析。

图3B、C和D显示了门、类和属级别的微生物群落的分类组成。在门级别（图3B），微生物群落结构主要由九门组成。在H微观世界中，拟杆菌和厚壁菌明显促进并代表优势门，同时抑制钙地霉、氯曲菌、酸性细菌和变形菌。在M微观世界中，钙质细菌和酸性细菌受到抑制。除了在第15天，L和C微观世界中的氯屈曲增加和变形菌和钙地霉减少外，L和C微观世界显示出相似的分布。图3C显示了相对丰度超过1%的类别。结果表明，在任何时候接受SPC处理的微观世界中，钙中毒都有所减少。在H微观世界中，嗜酸杆菌、Holophagae、Caldiserica和Deltaproteobacteria急剧减少，而梭状芽孢杆菌显着增加。在M微观世界中，α变形菌在第37天和第50天急剧增加，同时钙质减少。

图3。微生物群落结构分析。（A）。基于Bray-Curtis距离的NMDS排序图；（B）门的分布（相对丰度）≥1%);（C）类别分布（相对丰度）≥1%);（D）属水平的热图和聚类分析（显示为类/属水平）（相对丰度）≥0.1%，对数10标度）；（E）微生物群落功能群的相对丰度（任何示例的相对丰度>1.5%）。


在属水平上，获得了37个属（相对丰度）≥1.0%）和双聚类分析的热图（hclust）用于描述其差异（图3D）。聚类结果表明，M微观世界中的属与H微观世界中的属更相似，而与L和C微观世界中的属更相似。此外，37个属可分为三类：HA（高丰度，从B7到B16）、MA（中等丰度，从B17到B37）和LA（低丰度，从B1到B6）。在HA组中，10属代表了C微观世界中的优势类群，其中大部分属于Deltapoteobacteria类，仅在H微观世界中减少。其他处理效果不明显。在马，属属于各种类型的类。在第15、37和50天，WCHB1-69家族中的B17硫曲菌属和B18属在M和H微观世界中均明显减少，而在第15、37和50天，Coriobacteriae家族中的B19苯杆菌属、B20溶杆菌属和B21属增加。从B26到B30的细菌在H微观世界中明显减少。在第15天、第37天和第50天，H和M微观世界中的LA属增加，尤其是B5 Petrimonas和B6 Proteininclasticum。在第37天和第50天，M微观世界中的B4短枝单胞菌明显增加。


图3E显示了自然微生物群落的前八个功能组（相对丰度>1.5%，详细数据和其他组如表S4所示）对时间和SPC剂量的响应。在H微观世界中，能够进行化学异养、发酵、需氧化学异养、尿素分解和壳聚糖分解的微生物在整个取样时间内增加。能够进行硫酸盐呼吸和硫化合物呼吸的微生物在第0天增加，之后开始减少。能够暗氧化含硫化合物的微生物在第0天减少，在第15、37和50天增加。除了能够呼吸硫化物的微生物外，在M微观世界中，硫酸盐呼吸和硫化物的暗氧化在第50天减少。其他六组随时间增加。在L微观世界中，八组的顺序保持不变，尽管它们在第50天减少。


3.4.添加SPC后微生物群落的环境变量、所考虑的属和功能组之间的关系


图4A显示了八个功能群与37个属之间的显着spearman相关性（p<0.05）。一方面，能够发酵和化学异养的微生物与Petrimonas属、嗜蛋白菌属、苛孢霉属、破蛋白菌属和未培养的细菌呈梭状芽孢杆菌的顺序呈强正相关（系数>0.6）。能够解脲的微生物与蛋白碎屑菌和梭菌的顺序呈强正相关。此外，能够进行几丁质分解的微生物与苯杆菌、溶杆菌和短杆菌密切正相关。此外，能够进行硫酸盐呼吸和硫化合物呼吸的微生物与联营养菌、联营养菌、联营养菌和联营养菌科细菌密切正相关。另一方面，能够发酵和化学异养的微生物与Smithella、Caldisericum以及不同类别（B28和B30）和不同家族（B29、B32和B18）的细菌具有强烈的负相关。能够解脲的微生物与史密氏菌和OPB35类细菌呈强烈的负相关。

图4。添加SPC后，环境变量、所考虑的属和官能团之间的相关性分析。（A）功能群与所考虑属之间的Spearman相关分析；（B）显示了环境变量和考虑的功能组之间的spearman相关分析（显着相关（p<0.05），蓝色和红色圆圈分别表示正相关和负相关，行和列用hclust聚集；*表示系数大于0.6或小于0.6）；（C）基于环境变量和37个属的RDA分析。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参考本文的Web版本。）


图4B显示了环境变量和功能组之间的显着spearman相关性；表明大多数环境变量与功能组呈正相关。简单地说，硫酸盐主要与硫酸盐呼吸和硫化物呼吸密切正相关。DOC、碳酸盐和磷酸盐与发酵、化学异养、尿素分解和需氧化学异养密切正相关。


RDA图显示，37个属和环境变量可分为四个部分，由矩形轴分隔（图4C）。在第一象限中，磷酸盐、DOC和碳酸盐主要与B9、B6和B3有关。在第二象限，硫酸盐主要与B14和B26属有关。在第三象限中，B17、B18、B16和B7主要与ORP相关，与pH呈负相关。在第四象限中，铵主要与B2、B19和B4属相关。AVS主要与B20相关。


4.讨论


一般来说，各种化合物，如氨、硝酸盐、硫酸盐、有机污染物和金属离子，共存于受污染的沉积物中。其中一些可以用作天然微生物的电子受体或供体。在本研究中，环境条件与SPC剂量之间的线性关系（图1a和表S1）表明，SPC添加量越高，导致溶解物质增加，并降低受污染沉积物中的ORP。此外，水生生态系统中的溶解有机物含有氧化还原活性部分；ORP的下降表明溶解有机物的这些氧化还原部分被氧化，因为氧化部分具有还原电位Eh（Lau等人，2017）。这可能是部分氧化效应（De la Calle et al.，2012）和SPC的洗涤效应共同作用的结果。SPC通常被用作H2O2的来源，H2O2是一种强氧化剂，也是洗涤剂的主要成分（Zonfrilli et al.，2009）。此外，环境条件的后续变化，包括硫酸盐还原率升高（图1b-h）、AVS回收量（图S1）、溶解有机物还原（图S2）、有机酸生产（表S3）和ORP升高，这表明产生的氧化有机物和硫酸盐被本地微生物群落利用。此外，AWCD结果（图2）表明，微生物群落的不同代谢活性已增强。此外，在不同时期，代谢活动增强（杂项和碳水化合物，图2B）和功能微生物份额增加（硫酸盐呼吸和发酵，图3E），表明激活的微生物呼吸仅在实验开始时保持，并且在整个实验过程中发酵得到增强。总之，这些结果表明，添加SPC可间接提供电子受体或供体，以改善污染沉积物中微生物的代谢活性。这是一个有利于降低生态工程成本的策略，特别是对于原位生物修复。


近年来，由于非培养方法的快速发展，微生物群落结构的研究受到了前所未有的重视。微生物群落在分类组成上表现出强烈的差异，而其代谢功能和性能可能保持不变（Louca和Doebeli，2017）。因此，彻底调查微生物群落对添加SPC的反应需要对分类组成和功能分析进行共同解释。获得的阿尔法多样性结果（表1）表明，在SPC的H剂量下，微生物群落的异质性可能会下降。获得的分类学水平结果表明，在SPC的H剂量下显着增加的微生物主要属于厚壁菌门（其中许多产生内孢子（Onyenwake et al.，2004）），专性厌氧类梭状芽孢杆菌（川崎等，1998年）、发酵类Petrimonas属（Grabowski等，2005年）和蛋白水解类Proteinicreticum属（Zhang等，2010年）。此外，在M剂量SPC下增加的微生物主要属于α蛋白细菌类（在有机富集沉积物中对有机物的分解和同化具有重要作用的细菌（Kunihiro等人，2011））和异养菌属Brevundimonas（Tsubouchi等人，2014）。相比之下，嗜酸性细菌门、Caldisericia类（硫代硫酸盐还原菌（Mori et al.，2009））、Holophagae（其成员能够厌氧降解芳香化合物（Anderson et al.，2012））、硫氧化菌属Sulfuricurvum（Haaijer et al.，2008；Kodama和Watanabe，2004），鞘氨醇杆菌科的一个属（Schmidt et al.，2012）是SPC M和H剂量下最脆弱的微生物。受影响的微生物群落在更高的分类水平（如类群或门水平）表现出与属水平相似的重叠和分类丰度，这表明SPC的加入可能会影响特定狭窄分支内的特定属。此外，在整个实验期间，所有这些效应很难自发恢复到原始状态。关于功能性基团，获得的结果（图3E和表S4）表明，在所有试验期间，在M和H剂量的SPC下，最丰富的基团没有改变，对发酵、化学异养、尿解和需氧化学异养的影响都是积极的。然而，在试验后期，H剂量对硫酸盐呼吸和硫化物呼吸的影响为负。这些发现表明，微生物群落的分类组成和功能组对添加SPC的反应均表现出剂量依赖性偏差。这表明在生态工程中应考虑SPC的剂量。


先前的研究报告了地球化学成分变化与群落结构变化之间的显着相关性（Jorgensen等人，2012年；Louca等人，2017年）。在本研究中，改变的环境变量、显着增加的微生物组和功能性微生物的优势之间的强相关性（图4）表明，添加SPC后，DOC、碳酸盐和磷酸盐是主要变量，富集了特定的微生物，脆弱的微生物组群归因于ORP。然而，除了显着增加的微生物与上述功能微生物之间的相关性外，之前的研究报告称，Petrimonas是产氢细菌（Sun等人，2015），脱氮系统中的蛋白碎屑菌通常非常丰富（Wang等人，2015；Yang等人，2015），柴油中发现了Brevundimonas（Wang等人，2016）。此外，杂项组的代谢活动增强（图2b）。很可能，增加的属可能具有不同的代谢能力，并可能参与沉积物修复中污染物的后续生物修复。


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