2.材料和方法


2.1.实验程序


沉积物取样于中国珠江三角洲容桂镇（22°450 N，113°150 E）的一条受工业和生活废水污染的城市小溪。这条小溪氧气有限，有一股特有的臭味。使用前，使用0.149-mm的筛子对沉积物进行筛分、均质，并在25°C的暗处储存。批量试验采用以下程序：首先，在40ml棕色小瓶中构建90个微观世界，其中含有25g原始沉积物（含水量~60%，氧化还原电位（ORP）~-200mV）和5ml消毒水。其次，将纯水（作为对照）和五剂SPC溶液（Alfa Aesar，中国）注入微宇宙，使微宇宙中的SPC含量增加到5.6、11.2、16.8、22.4和33.6 mmol SPC g-1湿沉积物。最后，用聚四氟乙烯盖密封小瓶，立即摇动以实现均质，并在25°C的黑暗中静态储存。所有治疗均一式三份进行。在添加SPC后3小时（称为第0天）、15天、37天和50天，对五个处理组和对照组的每18个样本进行分析。


在每个取样时间点，摇动18个微观世界以实现均匀化。首先，用微电极测定pH和ORP（丹麦Unisense）。然后，提取三份0.5 g沉积物并储存在?80°C下：一份用于测试第2.2节所述的本地微生物群落的潜在代谢活性；第二部分用于提取16S rRNA基因，以进行第2.3节所述的高通量测序；第三份用于测定酸挥发性硫化物（AVS，数据如图S1所示）。以3000 rpm离心残余沉积物15分钟，并通过0.45-mm膜过滤上清液以获得沉积物的液相。这用于测定溶解物质，包括硫酸盐、硝酸盐、铵、磷酸盐、无机碳（碳酸盐）和溶解有机碳（DOC）。使用离子色谱仪（Thermo-DIONEX，ICS-11OO（KOH用作流动相）和ICS-900）测试无机盐，使用TOC分析仪（Elementar Vario TOC，德国）测试DOC。


2.2.本地微生物群落潜在代谢活性的测定


如前所述，本地微生物群落的潜在代谢活性由Biolog生态板（Biolog，美国）确定（Gu等人，2014年）。简言之，将0.5 g湿沉积物和4.5 mL 0.9%NaCl（pH¼7.0）超声处理八次（每次15秒）（KQ-300DE，柯桥），然后沉淀0.5 h以从沉积物中释放细菌。之后，提取1 mL悬浮液并添加到新的离心管中，用0.9%的盐水替换液体两次，以去除溶解物质。在600 nm处，将替换悬浮液的吸光度稀释至0.05±0.01，以确保每个样品包含大致相同的生物量浓度。最后，向ECO板的每个孔中加入150 mL稀释溶液。ECO板在30°C的黑暗中孵育。在最初12小时后，然后每24小时（直到148小时）使用微孔板读取器（Multiskan GO，Thermo）测量595 nm处的吸光度，以获得ECO板所有31个碳源的平均井色显影（AWCD）。


2.3.DNA提取、16S rRNA基因测序和分析


根据先前的研究进行了DNA提取和纯化（Fang等人，2015）。使用条形码引物314F（50eCCT ACG GGN GGC WGC AG-30）和805R（50-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-30）扩增16S rRNA基因的V3þV4高变区（Vasileiadis等人，2012年）。使用Illumina Miseq PE300作为测序平台，配对末端读数与FLASH（v2.2.00）连接在一起（Magoc和Salzberg，2011）。在Mothur（v1.39.5）（Schloss等人，2009年）中进行了质量控制，包括去除低质量读取、嵌合序列和V3þV4区域的碱基。


随后的分析在Louca（Louca et al.，2017）描述的QIIME（v1.9.0）（Caporaso et al.，2010）中进行，并进行了修改：根据97%的相似性阈值（Edgar，2010），对照SILVA数据库（版本123），将高质量序列聚类到操作分类单元（OTU）。这包括usearch的内置嵌合体检查。分类信息通过Uclust方法分配给每个OTU。在这些初步分析之后，获得了由1339个OTU组成的OTU表，其中每个样本的读数介于12777和42044之间。OTU表被细化为每个样本12777次读数，以便后续分析。


2.4.数据分析


对于多重比较，在SPSS（v20.0）中进行T检验（p<0.05*、p<0.01**和p<0.001***）和邓肯检验的方差分析（a¼0.05）。进行了以下统计分析：（1）非度量多维标度（NMDS）、使用距离矩阵的排列多元方差分析（Adonis）、相似性分析（Anosim）和多反应排列程序（MRPP）。使用R studio（v3.3.2）确定微生物群落的总体变化；2）在QIIME中分析了微生物群落的α多样性值；3）采用层次聚类法比较微生物群落的分类组成；4）此外，为了将微生物群落与一个或多个感兴趣的代谢功能相关联，如Louca等人（2016）所述，使用原核生物分类群的功能注释（FAPROTAX）算法预测功能组；5）在R studio中，通过冗余分析（RDA）分析环境变量和微生物组成（被认为是属）之间的关系；6）spearman秩相关分析在R studio中进行，以调查（a）功能组和环境变量之间的关系，以及（b）功能组和所考虑的属之间的关系。


环境变量和微生物群落对污染沉积物中添加过碳酸钠的响应——摘要、介绍

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