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结果
沉积物的理化性质
在布多池地下水排放点附近观察到橙色絮状沉积物（图1A）。 流出的地下水（从图 1A 中的管道流出的水）中 Fe2+ 的浓度为 292 lM（表 1），高于 Kato 等人先前在开放池塘水中观察到的浓度（8 lM）。 (2012)。 全年测得的地下水平均温度约为 16 °C。 在距地下水源 30 厘米处收集的沉积物核心显示出明显的颜色变化，具体取决于深度（图 1B）。 沉积物上部 2 cm 处呈橙色，而 2 cm 以下处沉积物呈绿褐色。 2 cm 以下的沉积物具有糊状质地，表明与较松散的上表层（即 0-2 cm）相比固结增加。
表 1 地下水源的主要元素化学（管道见图 1A）。 标准偏差由样品的重复测量（Fe2+和碳酸氢根）或标准的三次测量（Fe2+和碳酸氢根以外的元素）计算
使用微电极以 1 mm 或 2 cm 的间隔确定 0-10 cm 深度的孔隙水 pH、Eh 和 DO 的垂直剖面（图 2）。 观察到 DO 随着沉积物层加深而不断减少，并在沉积物深度低于 3 cm 时完全耗尽。 沉积物表面的 Eh 为 208 mV，观察到 Eh 在 1 cm 深度处略有下降。 Eh 在 2 到 3 cm 的深度从 123 mV 显着降低到 -92 mV。 在 3 cm 以下的深度，Eh 逐渐降低至 -312 mV。 0 到 1.5 cm 深度之间沉积物的 pH 值从 6.5 略微下降到 6.1。 相比之下，1.5 到 4 厘米深处的沉积物的 pH 值从 6.3 增加到 7.4。 在 4 厘米以下的深度，pH 值从 6.5 到 7.0 不等。
图 2 pH、溶解氧 (DO) 和氧化还原电位 (Eh) 的微电极曲线。 测量间隔为 1 毫米（深度在 0 到 4 厘米之间）或间隔为 2 厘米（深度低于 4 厘米）。 误差棒代表单个核心中同一点的三次重复测量的标准偏差。 不可见的误差线适合这些点。
沉积物中主要离子的孔隙水剖面
图 3A-E 显示了孔隙水中主要离子的垂直分布。 1 到 7 cm 深度之间的太阳能根浓度几乎保持不变，然后在 9 cm 处增加到 12 lM（图 3A）。 硫根浓度在 2 cm（38 lM）深度达到峰值，然后在 6 cm 处逐渐下降约 8 lM，然后在 9 cm 处再次增加到 19 lM（图 3A）。 Mn2+ 浓度在 3 cm 深度达到最大值，然后在 3 cm 以下下降（图 3A）。 溶解的 Fe2+ 浓度在 1 厘米深度处最低，然后在 2 厘米以下增加到 4 厘米处的最大值，然后在更深层中显着降低（图 3B）。 与 Fe2+ 分布相似，碳酸氢根浓度从 1.4 mM（在 1 cm 的深度）增加到 2.5 mM（在 4 cm），然后在低于 7 cm 的深度下降到大约 1 mM（图 3B）。 醋酸盐和 NHþ4 的浓度随着深度的增加而增加（图 3C、D）。 其他离子如 Na+ 、K+ 、Ca2+ 和 Cl 的垂直分布？ 没有显示任何显着变化（图 3D、E）。 还在 1.5 米半径内从池塘中其他沉积物收集的几个岩心中测试了不同水平位置的浓度变化。 尽管绝对浓度之间存在差异，但主要离子的垂直分布在所有分析的核心中是相似的（数据未显示）。
菊的浓度及稳定碳氢同位素组成
1 到 6 cm 沉积物深度之间的孔隙水浓度几乎恒定，范围从 257 到 398 lM（图 3F）。 浓度最初在 6 cm 深度增加，最大值 (993 lM) 在 8 cm 处观察到。
7 cm以下的孔隙水浓度较高，测得了呼吸的稳定同位素值。 d13C 的值范围为 -68.4& 至 -68.8&，dD 的值范围为 -287& 至 -328&（图 4）。 根据 Whiticar (1999) 的分类，这些值处于或接近微生物发酵的范围，特别是由醋酸碎屑和甲基营养甲烷产生的发酵。
图 沉积物中孔隙水 d13C 与 dD 的关系，基于 Whiticar（1999）分类。 d13C 和 dD 的稳定同位素值在 7 到 10 厘米之间的沉积物深度绘制在或接近由醋酸碎屑和/或甲基营养产甲烷菌产生的范围内。 误差棒是从标准的三次重复测量中计算出来的。
沉积物铁矿物学
在氧化还原分层沉积物中，由 6 M HCl 提取的 Fe 含量从 1 到 10 cm 几乎是均质的（40-45% (wt/wt)；表 2）。 用 0.5 M HCl 处理后，1 cm 深度沉积物中的 Fe 含量为 34% (wt/wt)，占此时 6 M HCl 可提取 Fe 的 82%。 0.5 M HCl 可萃取铁的浓度随着深度的增加而降低，并在深度低于 5 cm 时达到 <13% (wt/wt) 的值。 通过扫描电子显微镜检查的所有深度都观察到丝状鞘和扭曲的茎（图S1A，S1E）。
表 2 干沉积物深度中 6 M HCl 可萃取 Fe 和 0.5 M HCl 可萃取 Fe 的浓度 (wt/wt)。 从重复测量计算标准偏差
沉积物中铁矿物成分的变化是通过散装铁 K 边缘 EXAFS 分析确定的（图 5A）。 EXAFS 光谱的变化主要在 2 到 4 厘米的深度处观察到。 EXAFS 的空间变化的特征在于（i）在 k = 5.0 和 6.3 之间是否存在宽肩？ A-1 和 (ii) k 处的峰值位置和振荡幅度的变化范围从 6.9 到 7.9 A-1（图 5A 中的箭头和灰色阴影指示的区域）。 在 k 范围在 2.5 和 10.5 ? 一种？ 1(图5B)。 在 1 到 2 厘米的深度之间，拟合结果表明水铁矿是唯一存在的女性物种。 然而，在 3 cm 以下，除了水铁矿之外，还发现菱铁矿和针铁矿。 菱铁矿的估计比例在 3 至 4 厘米深度之间从 15% 增加到 25%，并在 4 厘米以下深度保持相对稳定。 针铁矿的比例在 3 到 10 厘米之间从 16% 到 28% 不等。 建议的菱铁矿和针铁矿存在于 3 cm 以下的深度与 X 射线衍射（XRD）分析的结果一致（图 S2）。 基于所述拟合结果，水铁矿似乎是在所有测试的深度（1-10厘米）占主导地位的铁矿物种。
在 CEY 模式下在 1 和 10 cm 沉积物深度获得的 Fe K-edge EXAFS 光谱如图 6 所示。 CEY 模式通常提供粒子表面亚微米级的探测深度，因为有限的逃逸深度电子（Itai 等人，2008 年）。 在 1 cm 处获得的 CEY-EXAFS 光谱显示 EXAFS 特征类似于散装 EXAFS 光谱的那些特征，除了 k 处的峰值位置范围从 7.4 到 7.6 ? 一种？ 1（图 5A 和 6）。 通过线性组合拟合（k 范围 = 2.5 至 8.0 ? A? 1 ）对 Fe 矿物种类分布的定量估计表明，1 cm 处 73% 的 Fe 是水铁矿，而 27% 是针铁矿（表 3）。 与 CEY 和块状 EXAFS 结果在 1 cm 处的相似性相反，10 cm 深度处的 CEY-EXAFS 光谱与块状 EXAFS 的光谱不同。 CEY-EXAFS 在 k = 4.4 处达到峰值？ 一种？ 1 和 k 处的振荡幅度为 6.4 ? 一种？ 1 到 7.6 ? 一种？ 1（图 6 中由灰色阴影表示的区域）对于 CEY-EXAFS 是独特的，这在批量 EXAFS 中没有观察到。 CEYEXAFS 光谱在 10 cm 处的线性组合拟合表明针铁矿、水铁矿和菱铁矿分别占总铁矿物分布的 65%、20% 和 15%。 CEY-EXAFS 拟合估计的水铁矿比例小于散装 EXAFS 拟合估计的比例（52%）。
图 5 (A) 沉积物样品和参考矿物的 k3 加权 X 射线吸收精细结构 (EXAFS) 光谱。 实线表示原始 EXAFS 光谱，虚线表示线性组合拟合。 箭头和灰色阴影突出了光谱特征，以便可以看到每一层的变化，尤其是 2 到 4 厘米之间的深度。 (B) 使用水铁矿、针铁矿和/或菱铁矿作为参考矿物，通过线性组合拟合获得的每层中 Fe 矿物的百分比。
图6 1、10 cm沉积物深度与参考矿物的k3加权转换电子产率X射线吸收精细结构（CEY-EXAFS）光谱。 实线表示原始 EXAFS 光谱，虚线表示线性组合拟合。 灰色阴影突出了 10 cm 深度处 CEY-EXAFS 特有的光谱特征。
TEM 观察揭示了在茎和鞘周围沉淀的矿物的形态特征和空间排列（图 7A、F）。 在 1 cm 深度处，茎和鞘表面覆盖有细颗粒的短程有序 Fe(III) 羟基氧化物，其由球形聚集体（直径 25-50 nm；图 7A）组成。 然而，在3 cm以下沉积深度处茎和鞘周围的Fe矿物形态特征与在1 cm处观察到的不同。 在这些更大的深度（例如，4 和 7 厘米），茎和鞘表面镶嵌着针状微结构（30-70 纳米长和 5 纳米宽；图 7B、D）。 尽管大多数针状矿物显示出宽选区电子衍射 (SAED) 图案，但在 2.8 ? A（图 7E、F）。 已知菱铁矿在 ~2.8 处具有强烈的 SAED 反射？ A (Graf, 1961) 并且根据 EXAFS 和 XRD 分析建议存在菱铁矿，我们得出结论，针状矿物很可能是菱铁矿。 针状矿物还显示 4.1、2.6 和 2.4 的 d 间距值？ A、与针铁矿的SAED反射一致。
图7 Fe矿物在1 cm (A)、4 cm (B, C)和7 cm (E)沉积深度的茎和鞘周围沉淀的代表性TEM图像和针状晶体的选区电子衍射(SAED)图4 cm (E) 和 7 cm (F) 处的矿物质。 短程有序 Fe 羟基氧化物覆盖 1 cm 处的鞘表面 (A)，而针状菱铁矿和针铁矿覆盖 4 和 7 cm 深度处的茎和鞘表面 (B、C 和 D)。 E 和 F 中的 SAED 环形图案表明菱铁矿的间距为 2.8。
沉积物中细菌和古菌 16S rRNA 基因系统发育型组成
进行 16S rRNA 基因分析以确定沉积物中的细菌和古菌系统发育型。 16S rRNA基因分析选择3个沉积层：1~2 cm（表层）、cm（孔隙水中Fe2+和粗氢氢根浓度出现最大值的深度）和10 cm（深度为观察到相对较高）。 表层沉积物通常与 Fe(II) 氧化相关，而在 4 和 10 cm 处的深层微生物群落预计分别包含与 Fe(III) 还原和还原产生相关的微生物群落。 共获得 250 个克隆（每层 82-86 个克隆），平均读取长度为 450 bp。
在表层沉积物（1-2 cm）中，在克隆文库中检测到 Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria 的系统发育型（图 8A）。 在 Betaproteobacteria 中，从克隆库中检测到 Gallionellaceae 科，其中一些系统发育型与著名的化学自养 Fe(II)-氧化细菌 G. ferruginea 密切相关（图 8B-1）。 还检测到与 Comamonadaceae、Rhodocyclaceae 和 Geobacteraceae 密切相关的 Fe (III) 还原菌（图 8B-1）。 其他检测到的系统发育型与嗜甲基菌科和甲基球菌科中的甲烷/甲基营养菌有关（数据未显示）。
图 8 (A) 沉积物深度 1 cm 和 2 cm（表层）、4 cm 和 10 cm 处细菌和古菌数量的比例和细菌系统发育的分布。 (B-1, B-2) 从表层沉积物 (1 和 2 cm)、4 cm 和 10 cm 中获得的细菌 (B-1) 和古菌 (B-2) 序列的最大似然树。 粗体字母表示本研究中检测到的克隆。 以粗体字母显示的封闭数字表示检测到的克隆数。 Bootstrap 值（高于 50%）基于 100 次重复。
在 4 cm 沉积物深度处，在门水平的克隆文库中检测到 Deltaproteobacteria（图 8A）。 在该层中还鉴定了 Chloroflexi 系统发育型。 从 Deltaproteobacteria 检索到的系统发育型之一与地杆菌科有关（图 8B-1）。
在 10 cm 沉积物深度处，检测到 Deltaproteobacteria 系统型（图 8A）。 在该层中检测到的大多数系统发育型与孤立物种的序列远相关。 除了细菌外，在这一层中还发现了古细菌。 一种系统发育型与甲烷八叠球菌目中的 GOM Arc I 组有关（图 8B-2）。
讨论
Fe2+ 在沉积物表面的生物和非生物氧化
在研究地点，富含铁的沉积物存在于地下水源附近。 1 cm深度处的Fe2+浓度低于流出地下水源中的Fe2+浓度，1 cm和2 cm处沉积物以水铁矿为主。 这些结果表明在沉积物表面发生了生物和/或非生物 Fe2+ 氧化。 Fe2+ 的细菌有氧氧化一般表示如下（Emerson et al., 2010）：
沉积物深度从 0 到 1.5 cm 处 pH 值的轻微下降与 Fe2+ 氧化以及 Fe(III) 水解和/或有氧呼吸期间预期发生的质子释放一致。 在中性 pH 值下，微生物 Fe2+ 氧化在低氧和高 Fe2+ 环境中可以超过非生物氧化（通常，DO 浓度 <50 lM；Druschel 等人，2008 年）。 在我们的研究地点，表层沉积物中的溶解氧浓度接近饱和 (266 lM)，表明非生物 Fe2+ 氧化过程在表层沉积物中主导了微生物 Fe(II) 氧化。 然而，TEM 观察显示精细的 Fe(III) 羟基氧化物颗粒沉淀在生物源茎状和鞘状结构附近 1 cm 深度，这些颗粒具有生物源 Fe(III) 羟基氧化物的独特形态（Banfield 等al., 2000; Chan et al., 2009; Suzuki et al., 2011, 2012)。 上层微生物群落的 16S rRNA 基因分析结果表明存在氧化铁 (II) 的 Gallionellaceae 细菌种群。 尽管我们的数据不足以讨论沉积物中生物和非生物 Fe(II) 氧化率的比例，但 Fe(II) 氧化细菌活动可能在一定程度上促成了 Fe2+ 氧化。 在先前对该地点表层沉积物的 16S rRNA 基因分析中也检测到 Fe(II) 氧化细菌的存在（Kato 等，2012），表明生物和非生物 Fe2+ 氧化都有助于产生富含铁 (III) 的沉积物。
Fe(III)还原氧化有机碳氧化生产
2 到 4 cm 深度之间孔隙水 Fe2+ 浓度的显着增加表明 Fe(III) 还原发生在选定的缺氧层。 在氧气消耗后，微生物呼吸的主要电子受体依次为 NO3、Mn(III, IV)、Fe(III) 和硫酸根 (Froelich et al., 1979)。 在沉积物 10 厘米深度范围内，NO3 剖面存在较小的变化。 虽然沉积物中Mn(IV, IV)减少和硫酸根消耗似乎发生，但它们的速率远小于Fe2+的产生速率。 因此，在这些富含 Fe(III) 沉积物的缺氧部分，Fe(III) 羟基氧化物可能是微生物呼吸最有利的电子受体。 事实上，在上部（1 和 2 厘米）和稍深（4 厘米）沉积物中检测到一些与 Comamonadaceae、Rhodocyclaceae 和 Geobacteraceae 相关的异化 Fe(III) 还原细菌系统发育型。 这些系统发育型代表了在自然环境中发现的异化 Fe (III) 还原细菌的一些常见属（Lovley & Phillips，1988；Coates 等，1996；SnoeyenbosWest 等，2000；Finneran 等，2003；Anderson等，2006；Bl€othe & Roden，2009；Yu 等，2010；Roden 等，2012）。 异化 Fe(III) 还原产生了粗氢根和 Fe2+（方程 1）。 Fe2+与沉积物中2~4 cm深度处沉积物中的碳酸氢根呈正相关，表明这些层产生的碳酸氢根与异化Fe(III)还原有关。 总体而言，异化 Fe(III) 还原细菌的存在和观察到的化学特征表明，Fe(III) 羟基氧化物的微生物还原是参与 2 至 4 厘米深度沉积层中有机碳分解的主要过程.
在沉积物中，孔隙水中的 Fe2+ 浓度相对较低（例如，Fe2+ < 0.6 mM；沉积物深度低于 6 cm），观察到浓度低于 6 cm 的地方相对较高。 7 cm以下孔隙水低浓度的C和D值归因于乙酸碎屑和/或甲基营养产甲烷菌产生的微生物甲烷。 尽管我们没有进一步确定产甲烷途径是乙酰碎屑的还是甲基营养的，但有人认为乙酰碎屑产甲烷菌是大多数淡水环境中产甲烷的主要来源（Whiticar，1999）。 6-10 cm 区域孔隙水醋酸盐浓度相对较高，范围为 170 至 934 lM。 这些值高于在 2-5 cm 区域观察到的值，其中 Fe2+ 浓度更高，醋酸盐浓度范围为 25 至 117 lM。 这种情况是典型的 Fe(III) 还原剂和产甲烷菌之间竞争乙酸盐吸收的结果（Lovley & Phillips，1987b；Roden & Wetzel，2003）。 降低异化 Fe(III) 细菌活性所需的醋酸盐浓度下限远低于产甲烷菌（Roden & Wetzel，2003 年）。 因此，Fe(III) 还原菌可能将乙酸盐浓度维持在相对较低的浓度，其中 Fe(III) 还原菌在乙酸盐方面胜过产甲烷菌。 然而，产甲烷菌很可能在 7 厘米及以下的深度利用醋酸盐，预计异化 Fe(III) 还原菌的活性将受到抑制。 在 10 cm 深度检测到 GOM Arc I 组 Methanosarcinales 也表明深层沉积层中存在产甲烷活动。 尽管 GOM I 是未培养的且其代谢细节未知，但一些甲烷八叠球菌属物种利用各种有机碳分子如醋酸盐来产生甲烷弧 (Liu & Whitman, 2008)。 因此，在 Fe(III) 还原停止后，有机碳有望被产甲烷活动分解。 有机碳与铁的潜在氧化相结合，伴随着铁的潜在氧化产生（Lovley & Phillips, 1986a; Lovley & Phillips, 1987a; Roden & Wetzel, 1996, 2003; Teh et al 。，2008）。
淡水沉积物中水铁矿的有限减少
结果表明，针铁矿和菱铁矿主要存在于>3 cm 的沉积深度，而在位于 1 至 2 cm 深度的沉积物中未观察到它们。 此外，在孔隙水中观察到 Fe2+ 浓度增加的层中存在针铁矿和菱铁矿。 该结果表明针铁矿和菱铁矿作为次生 Fe 矿物沉淀，可能是在 Fe (III) 还原过程中。 针铁矿和菱铁矿的沉淀也与异化 Fe(III) 还原产生的次生铁矿物一致（Phillips 等，1993；Fredrickson 等，1998；Zachara 等，1998，2002；Liu 等， 2001；Hansel 等人，2003 年；Pallud 等人，2010a,b)。 3 cm 以下的茎和鞘表面内菱铁矿和针铁矿的异质沉淀表明存在支持针铁矿或菱铁矿沉淀的特定微环境（Fredrickson 等人，1998 年；Zachara 等人，2002 年）。
这项研究的一个重要发现是，铁矿物种类分布的变化似乎仅限于位于 3 到 4 厘米深度之间的沉积物，尽管在 4 厘米以下深度仍存在丰富的水铁矿。 考虑到有机碳似乎在 7 cm 以下的深度被产甲烷菌分解，水铁矿的不完全还原可能不是由于缺乏电子供体。
0.5 M HCl 在 1 cm 和 2 cm 深度提取的 Fe 量分别占 6 M HCl 提取的 Fe 总量的 81% 和 64%。 通常，除了一些 Fe(II) 和 Fe(II)-Fe (III) 矿物（例如菱铁矿和绿锈；Fredrickson等人，1998 年）。 鉴于水铁矿似乎是 1 和 2 厘米深度的唯一铁矿物种类，在这些深度用 0.5 M HCl 提取铁的高提取率可能是由于水铁矿溶解。 考虑到水铁矿占 3 cm 以下铁矿物总种类的 46-60%，根据 EXAFS 拟合估计，沉积物中几乎或超过一半的铁矿物应可用于 0.5 M HCl 溶解。 然而，在 3 至 10 cm 沉积物深度之间进行 0.5 M HCl 提取后，仍有 34-47% 的水铁矿残留，这代表了每个深度存在的 61-83% 的水铁矿。 这些结果表明，存在于 3 cm 以下深度的大部分水铁矿并未经过 0.5 M HCl 提取。 此外，考虑到针铁矿和菱铁矿在 3 cm 以下的深度开始沉淀，针铁矿和菱铁矿涂层可以保护水铁矿。
为了考虑深度低于 3 cm 的针铁矿和菱铁矿沉淀物的表面结壳的影响，我们通过 TEM 和 CEY-EXAFS 分析进一步确定了矿泉水界面处的 Fe 矿物种类及其分数。 在 1 厘米深的地方，生物茎和鞘上覆盖着 Fe(III) 羟基氧化物的细颗粒。 颗粒表面上的铁矿物似乎以水铁矿为主，并含有少量针铁矿，这与大部分铁矿物中水铁矿的优势一致。 然而，在低于 3 cm 深度的沉积物中，TEM 观察证实了针状针铁矿和菱铁矿在茎和鞘表面的沉淀。 水铁矿、针铁矿和菱铁矿在 10 cm 深度沉积物颗粒表面的含量分别为 20%、65% 和 15%。 这些分数与大量 EXAFS 结果不同，后者估计水铁矿、针铁矿和菱铁矿的分数分别为 52%、28% 和 20%。 使用散装和 CEYEXAFS 获得的矿物分数的差异表明，单个颗粒内的矿物沉淀是不均匀的。 此外，CEY-EXAFS 结果中针铁矿的优势和少量水铁矿表明针铁矿选择性地沉淀在矿物颗粒表面，而水铁矿主要存在于颗粒内部。 因此，针铁矿对水铁矿的结壳可能在缺氧沉积物中很重要。 在 3 cm 深度以下观察到的 0.5 M HCl 可萃取 Fe 的比例较低，这可能是由于针铁矿涂层，针铁矿通常不溶于 0.5 M HCl。
该研究观察到针铁矿在水铁矿发生不完全还原的位置涂覆在水铁矿表面上。 针铁矿对水铁矿的结壳可能降低了发生异化 Fe(III) 还原的可能性，也可能使在水铁矿存在的情况下发生甲烷生成。 这些结果支持了先前的发现，即次生 Fe 矿物的表面结壳在抑制异化 Fe(III) 还原方面起着重要作用（Urrutia 等，1998；Roden & Urrutia，2002；Pallud 等，2010a,b）。 据我们所知，这份手稿是第一项使用 CEY-EXAFS 定量证明淡水沉积物中存在次生铁矿物结壳的研究。 预计淡水沉积物中的扩散受限条件会导致小程度的 Fe2+ 对流去除，这可能导致局部沉淀和次生 Fe 矿物的表面涂层的发展。 次生 Fe 矿物的分布而不是 Fe (III) 羟基氧化物的矿物学可能是控制淡水沉积物中微生物 Fe(III) 羟基氧化物还原程度的重要因素。
