全球领先的微电极研究系统

二、材料和方法

坦普尔顿粉砂壤土 (Udic Ustochrept) 是从具有多年生牧场管理历史的田地中收集的，在牧场改造的耕作过程中从顶层（0e10 厘米深）开始，坎特伯雷林肯市 (43?38.720S;172?26.753) E 纬度/经度）。 坎特伯雷地区属温带地区，年平均降水量为 600 到 700 毫米，日平均气温范围为 1 到 10 ? C 在最冷的月份和 12e22 ? C 最温暖（Cappelen 和 Jensen，2001 年）。 Templeton 土壤和类似的 inceptisol 代表 app。 坎特伯雷平原的 25% (Molloy, 1988)。 温带地区的 Inceptisol 是氮肥投入高的土壤（Potter 等，2010），作物类型通常由大麦和小麦等谷物组成（Leff 等，2004）。

将取样的土壤风干、过筛（<2 毫米）并保持干燥和低温（4 摄氏度）。 测定土壤 pH 值（10 克风干土壤：25 毫升水）。 一半的土壤用 2.08 g Ca(OH)2 kg 1 干土壤（生石灰）以粉末形式处理，以将 pH 值提高一个单位。 石灰处理和由此产生的 pH 值增加与之前的实验一致（Clough 等，2003）。 测定未处理和石灰土壤的无机氮和溶解有机碳 (DOC)。 无机 N 在 2 M KCl 萃取中测定（4 g 土壤：70 mL KCl，在倒置式振荡器上摇动 60 分钟并通过 Whatman 42 滤纸过滤。使用 Alpkem FS3000 双通道流动注射分析过滤的样品分析器 (FIA) 和 Alpkem Winflow 4.03 软件）。 通过去离子水萃取（1:10 土壤:水比）分析 DOC，在颠倒的振动器上摇动 30 分钟，然后以 3500 转/分钟的速度离心 20 分钟，并通过 Whatman 42 滤纸过滤装入 30 mL 样品瓶中（Ghani 等人，2003 年）。 DOC 是基于总有机碳 (TOC) 和无机碳 (IC) 之间的差异确定的，该分析使用配备岛津 ASI-5000A 自动进样器的岛津总有机碳分析仪 (TOC-5000A)。

2.1. 核心准备

土壤被装入不锈钢金属芯 (D ¼ 7.4 cm) 用于微传感器测量或 PVC 塑料芯 (D ¼ 7.5 cm) 用于 KCl 提取（见下文）。 土壤核心基部用 1 毫米尼龙网覆盖并填充至 3.5 厘米深度。 土壤被分层填充以确保整个剖面的体积密度均匀，为 1 g cm 3。 进行了四种处理：对照（未添加土壤，TC），石灰土（土壤加石灰，TL），加氮土壤（土壤加硝酸盐-15N，TN）和加氮和石灰土壤（土壤加硝酸盐） -15N 和石灰，TLN）。 对于处理 TN 和 TLN，在填充土壤核心之前，将已知体积的富含 15N（50 原子%）的 KNO3 溶液（0.0154 M）喷洒到指定质量的干燥土壤上，提供 100 mg NO3eN g 1 土壤。 由于 NO3 均匀分布在耕作土壤的表面，因此 15NeNO3 被施用于填充土壤核心的整个土壤深度。 在淹水前立即用 KNO3 填充和调整土壤核心。 然后在开始微传感器测量之前立即从下方淹没土壤核心，通过将它们放置在充满水的盒子中来模拟高地下水位的上升。 这种土壤淹水方法也最大限度地减少了润湿过程中的土壤排水。 总共制作了 108 个核心，其中 12 个用于微传感器测量，96 个用于 KCl 提取。 对于每个处理，在 8 个时间步长上重复进行三次 KCl 提取。 KCl 提取的时间分布在整个 N2O 生产脉冲中（参见支持信息 (SI)（图 S1））。 由于微传感器的测量限制，通过在任何给定时间连续测量一种处理的一个土壤核心来及时进行复制。 对于每个处理，在 t1、t2 和 t3 测量总共 3 个重复。 在实践中，每个处理（在 t1 和 t2）的两个重复被测量。 所有四种处理的所有 t1 和 t2 测量均在 50 天内完成。 随后在此时间段之后测量所有 t3 测量值（有关所有处理的 t1、t2 和 t3 时间的确切规格，请参见 SI 图 S2）。 在测量下一个土壤核心之前，跟踪每个土壤核心直到不再释放出 N2O（直到 7 天），因此一次只有一个用于微传感器测量的土壤核心被淹没。 土壤保持筛分，但在 4 ? C 且未经 15N 修正，在微传感器测量开始之前执行这些程序。

2.2. 微传感器

使用标准 N2O 微传感器（N2O-100，Unisense，Science Park，DK-8000 Aarhus，Denmark）、氧化还原微传感器（RD-100，Unisense）和氧化还原参比电极（REF-RM，Unisense）测量 N2O 浓度以及来自土壤：水界面的氧化还原电位，以 500 mm 的步长向下穿过土壤剖面（每个剖面 71 个点），运动由电动显微操纵器控制。 为确保土壤上方的水相完全混合，在水面上产生环境空气流，以避免 N2O 在覆盖土壤核心的水中积累。 为确保土壤水分始终保持在恒定水平，每天加水数次以抵消任何蒸发，保持土壤表面上方 1 厘米的水深。 N2O 微传感器的输出电流使用微传感器万用表测量，而氧化还原信号使用 pH/mV-METER 测量。 N2O 微传感器使用饱和 N2O 溶液进行五点校准，使标准溶液每步增加 100 mM。 分析后的重复校准显示仪器漂移微不足道。 每个土壤核心剖面每两小时测量一次，持续 7 天，或者直到所有深度的 N2O 浓度低于检测极限 (<0.1 mM)。 微传感器测量期间的室温在 21e23 ? C. 基于微传感器测量，使用克里金插值法（Surfer 版本 9.785，Golden Software Inc.，Colorado，USA）构建地下 N2O 浓度和氧化还原电位的等高线图。

2.2.1. 通量测定

根据 Elberling 和 Damgaard（2001 年）的说法，观测到的来自淹没土壤核心的 N2O 通量被确定为穿过扩散边界层 (DBL) 的扩散气体交换。 DBL 是土壤：水界面（通常 < 2 mm）上的一层水薄膜，其中唯一的传输形式是分子扩散（Gundersen 和 Jørgensen，1990）。 DBL 上的线性浓度梯度用于使用 Fick 定律（Clough 等人，2005 年）确定穿过 DBL 的 N2O 通量。 N2O 在水中的扩散系数为 20 ? C 被认为是 2.2295 ? 10 5 cm2 s 1 (Ramsing and Gundersen, 2009)。 通量的验证基于黑暗的封闭室（INNOVA 1313，LumaSense，Inc.，Ballerup，Denmark），其中观察到的通量与微传感器测量后立即进行的室测量进行比较（参见 SI 图 S3）。

2.2.2. N2O 生产和消费建模

假设 N2O 浓度分布代表伪稳态，则使用 SensorTrace PRO 3.0 程序（Unisense A/S，Science Park，DK-8000 Aarhus，Denmark）对特定深度的 N2O 生产和消耗区进行建模。 该程序基于 Berg 等人的模型 PROFIL。 (1998)。 这里通过土壤的有效气体扩散系数被描述为充满水的孔隙空间、土壤孔隙度和相关的气体通过空气扩散系数的函数（Berg 等，1998）。

2.3. 氯化钾萃取

根据使用微传感器测量的土壤核心中最大 N2O 浓度的初步结果，为随时间分布的每个处理选择了 8 个 KCl 提取时间步长：在零时间进行一次提取（随后用作参考对于初始条件），在时间零和最大 N2O 浓度之间进行了三个进一步提取，然后在最大 N2O 浓度之后进行了两次进一步提取，并在 N2O 不再可测量时进行了最终提取（有关详细信息，参见 SI 图 S1)。

在 KCl 提取之前，将被淹没的岩心移除以排出应用程序。 10 分钟。 取自岩心顶部 (0e 1.2 cm) 的 10 g 土壤子样品在 107 mL 玻璃瓶中与 60 mL 2 M KCl 混合，该玻璃瓶盖有内衬橡胶隔膜的铝制螺旋盖，顶部空间为43 mL 并剧烈摇晃（30 秒）。 然后使用装有旋塞的气密注射器从顶部空间收集气体样品 (8 mL)，以防止样品压力不足，并储存在预先抽真空的 6 mL Exetainer? . 对于所有 15NeNO3 处理过的样品，以类似的方式额外收集 16 mL 气体样品，并将其置于预先抽真空的 12 mL Exetainer? . 然后将土壤/KCl 溶液在颠倒的振荡器上振荡 1 小时，静置 5 分钟，然后通过 Whatman 42 滤纸过滤到 30 毫升的样品瓶中并冷冻（20 摄氏度）直至分析。 对来自土壤核心中部 (1.2e 2.3 cm) 和底部 (2.3e3.5 cm) 的土壤样品重复 KCl 提取。 将每个深度的剩余土壤称重并干燥以确定重量含水量。

使用与 Gilson 222XL 自动进样器相连的 SRI 8610C 气相色谱仪（SRI，美国加利福尼亚州）分析 6 mL Exetainer 中的气体样品中的甲烷 (CH4) 和 N2O。 CH4 使用火焰离子化检测器 (FID) 测定，而 N2O 使用电子捕获检测器 (ECD) 测定，该检测器使用涵盖样品浓度范围的认证气体标准（BOC 气体）校准（Mosier 和 Mack，1980 年）。 使用连续流同位素比质谱仪 (IRMS) 在 Sercon 20-20 IRMS 上分析 12 mL Exetainer 中的气体样品中的 15NeN2O 和 15NeN2，并根据 Mulvaney 和 Boast (1986) 和 Stevens 等人的方程进行 15N 计算阿尔。 (1993)。 在计算土壤中夹带的 15N 标记气体的释放量时，使用适当的本生系数（Moraghan 和 Buresh，1977 年）进行修正以允许顶部空间气体溶解在 KCl 溶液中。 派生的 15N 数据允许在进行 KCl 萃取时观察到原始 15NO3 在无机 N 和气态 N 物质中的转化和重新分布。

土壤 KCl 提取物在室温下解冻，并使用 Alpkem FS3000 双通道流动注射分析仪 (FIA) 和 Alpkem Winflow 4.03 软件分析 NH4-N 和 NO3eN 浓度。 遵循布鲁克斯等人的方法。 (1989) KCl 提取物的子样品被扩散和分析，以确定它们的 NH4þe15N 和 NO3e15N 富集。

2.4. 统计分析

使用 SPSS 统计软件包 (v. 19.0) 对 Pearson 积/矩相关性、Ftest 和单因素方差分析进行统计分析，显着性水平至少为 95% (*P < 0.05)。 对于 KCl 提取，分析了三个重复 (n = 3)，而对于微传感器 N2O 测定，分析了两个重复 (n = 2)，t1 和 t2。

淹没所导致的一氧化二氮排放的爆发是受农业土壤的pH和硝酸盐的控制——摘要、简介

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