石墨烯因其独特的电学特性，是碳基生物传感器（如微电极和场效应晶体管）的有前景的候选材料。最近，石墨烯生物传感器已成功用于电生细胞的细胞外动作电位记录；然而，由于缺乏有效的细胞穿孔方法，细胞内记录仍超出其当前能力范围。在此，我们展示了一种由垂直生长的三维模糊石墨烯（3DFG）构成的微电极平台，能够以高信噪比记录细胞内的心脏动作电位。我们利用超快脉冲激光产生的热载流子来穿孔细胞膜，并在3DFG电极与细胞内域之间建立紧密接触。这种方法使我们能够检测药物对人源心肌细胞动作电位形状的影响。结合激光穿孔的3DFG电极可用于全碳细胞内微电极阵列，以监测细胞的电生理状态。


一、介绍


监测神经元和心肌细胞的电活动对于研究大脑和心脏的电生理学、探究神经退行性疾病或心脏疾病以及开发新的治疗策略具有根本的重要性。微电极阵列（MEA）平台因其能够通过同时测量数百/数千个细胞的电信号来监测大量细胞群而被广泛使用。特别是在体外应用中，由于最近采用了新型二维（2D）和三维金属电极配置，MEA方法在准确性与高通量之间提供了理想的平衡，这使得能够记录类似细胞内动作电位（AP）的信号。


石墨烯的非凡特性，如生物相容性、高电导率和柔韧性，使其成为开发用于研究可兴奋细胞电生理学的微电极阵列和晶体管的绝佳候选材料。然而，迄今为止，基于石墨烯的设备仅限于细胞外场电位（FP）记录，这无法像膜片钳技术那样捕捉到动作电位的主要特征。这极大地限制了石墨烯微电极在体外电生理学中的应用，因为准确监测细胞内动作电位的能力是毒理学研究和药物筛选试验的一项基本要求。


利用纳米材料（如多孔铂）在水中通过光能产生高能载流子（热载流子）已被证明能够以非常局部且非侵入性的方式穿孔细胞膜。在石墨烯基材料中，光照射已被证实能够产生热载流子。因此，激光刺激基于石墨烯的微电极阵列可能会导致局部细胞膜穿孔（光穿孔），从而实现细胞内记录。此外，增加石墨烯基电极的可用表面积有望在激光照射时产生更高程度的热载流子，从而降低穿孔细胞所需的激光强度。我们近期报道了一种高比表面积的石墨烯基纳米结构：三维毛状石墨烯（3DFG）。3DFG的形态使其成为实现可兴奋细胞光穿孔以进行细胞内电活动记录的理想候选材料。


在此，我们展示了利用3DFG多电极阵列（MEA）通过光穿孔进行心肌细胞动作电位（AP）的细胞内记录。在近红外（NIR）波段用超快脉冲激光照射时，3DFG电极中产生的热载流子使细胞膜得以光穿孔。光穿孔与3DFG的高有效表面积相结合，能够以高信噪比（SNR）记录动作电位，从而能够识别各种药物对心肌细胞离子电流的影响。通过心肌细胞-3DFG电极界面的横截面扫描电子显微镜（SEM）成像观察到，石墨烯薄片的垂直形态进一步导致细胞质膜与3DFG电极紧密贴合。这项工作将推动开发出柔韧、低成本且生物相容的全碳MEA平台，用于细胞内电活动记录。此外，在近红外二区（1000至1700纳米）中石墨烯的低功函数可能使细胞穿孔在较厚的组织和类器官中的应用成为可能，因为它们在近红外二区的吸收和散射较少。


二、结果与讨论


01.扫描电子显微镜、光学和光电特性表征


通过等离子体增强化学气相沉积（PECVD）按照先前报道的程序合成了3DFG。通过调整合成参数，例如合成时间，我们可以定制出平面外石墨烯薄片的尺寸和密度。按照标准的微纳加工工艺制造了功能性3DFG微电极阵列（MEA）（图S1；有关3DFG制造的详细信息，请参阅材料与方法）。在MEA制造过程中，3DFG的平面外形态得以保留，从而形成了高表面积的微电极（图1A和图S2；有关3DFG MEA的结构和电化学特性的详细信息，请参阅注释S1和S2）。

图1三维多孔金栅（3DFG）的扫描电子显微镜（SEM）成像和光学特性表征。（A）5微米3DFG电极的SEM图像。比例尺：5微米（I）、1微米（II）和0.5微米（III）。（B）熔融石英（灰色）、在800°C下合成10分钟的3DFG（红色）和在800°C下合成30分钟的3DFG（蓝色）的紫外-可见光吸收率随波长的变化。（C）3DFG在可见光和近红外范围内的介电常数的实部（ε1）和虚部（ε2）。（D）在1064纳米超快（皮秒）脉冲激光激发下，3DFG电极与磷酸盐缓冲液（PBS）界面产生的光电流，激光强度变化时的情况。脉冲序列持续时间为6毫秒。（E）激光激发产生的光电流的电容分量和法拉第分量。电容值取激光激发开始时的最大电流峰值。法拉第值计算为激光脉冲序列结束前最后1毫秒部分的平均值。


增加垂直于平面的石墨烯薄片的尺寸和密度会导致紫外-可见光（UV-Vis）吸收率上升，这从获取的UV-Vis光谱（图1B）中可以看出。增强的吸收可归因于垂直于平面的石墨烯薄片对光的捕获能力增强，因为这种结构类似于纳米纹理硅和碳超材料。为了研究3DFG的光学响应类型，我们对在800°C下合成90分钟的3DFG薄膜进行了表征，薄膜沉积在熔融石英基板上，通过椭圆偏振光谱法提取了材料在可见光和近红外范围内的介电常数（介电常数）的实部和虚部（图1C）。介电常数提供了入射光子与材料相互作用类型的信息。特别是，如果材料具有负实介电常数，并且与具有正实介电常数的材料（例如空气或水）相接，入射光子可以通过激发表面等离子体激元与之强烈相互作用。我们对3DFG介电常数的测量表明，在300至1700纳米范围内，3DFG并未表现出等离子体行为，其介电常数（ε1）为正值，如图1C所示。