2结果与分析


2.1电极预处理效果的电化学表征


由图2-A可以看出，电位差在80 mV以下，峰电流比值趋近于1。由图2-B可以看出，在不同扫描速率条件下(25、50、75、100、125、150、200 mV·s-1)，活化后的玻碳电极(GCE)还原峰和氧化峰电流均和扫描速率的平方根呈良好的线性关系，说明玻碳电极经过处理后其氧化还原峰电流仅受扩散条件控制，玻碳电极作为裸电极的预处理效果达标，可以进行后续的组装研究。

图2玻碳电极预处理效果的循环伏安法表征(A)及预处理后的玻碳电极的还原峰和氧化峰电流和扫描速率的关系(B)


2.2电极组装过程及电化学表征


由图3可以看出，在扫描速率为50 mV·s-1，扫描范围为-0.1~0.6 V的条件下，玻碳电极使用双核微孔膜组装后，由于核微孔膜阻碍了电子向电极表面的传递，所以峰电流值低于裸电极峰电流值;在两层膜中间组装上植物根尖分生组织后峰电流值进一步减小，这是由于植物根尖分生组织进一步阻碍了电子的传递。由图3峰电流的变化可以看出，该组织传感器组装成功。

图3循环伏安法对电极不同阶修饰段的表征


2.3电流—时间测定法的电位优化


将构建好的植物根尖分生组织传感器置于超纯水中，采用电流—时间法，在不同电位下测试。以加入1×10-6mol·L-1的尿素前后稳态电流差去衡量不同电位对该传感器电化学响应效果的影响。由图4可知，该传感器在-0.38 V时电流变化值最大，我们选择-0.38 V为恒电位进行植物根尖分生组织传感器对尿素传感动力学特性的研究。

图4电位对生物传感器响应效果的影响


2.4植物根尖分生组织传感器对尿素浓度的检测范围


将固定好的植物根尖分生组织传感器用不同浓度的尿素溶液刺激，浓度从低到高依次测定，时间—电流法扫描，扫描电位选择-0.38 V，静置10 s左右，使受体和尿素充分结合后，第100秒电流值为稳态电流，每组实验均平行测试3次，采用的数据是经仪器软件平均化后的响应电流，以减少误差。以电流在受体—配基结合前后电流的变化率△I为纵坐标，为方便后续计算以配基—尿素浓度C(mol·L-1)的对数值lg(C)为横坐标作图，结果如图5，在低浓度范围内，电流变化值呈线性增长，说明此时根尖对尿素的传感能力远大于尿素的量，后一部分呈曲线式缓慢增长，说明组织对尿素的传感能力已接近上限。实验目的是找到最小响应浓度，继续增大尿素浓度对后续细分测试浓度和联动变构常数的计算没有影响。因此，无需继续增加尿素浓度。

图5玉米(A)、辣椒(B)、花椰菜(C)和黄瓜(D)在检测范围内的电流变化率


由图5知，玉米、辣椒、花椰菜和黄瓜分别在10-9~10-3、10-16~10-6、10-19~10-10和10-20~10-10mol·L-1尿素的浓度范围内，响应电流的变化率随着浓度的增加呈现类似酶促反应动力学曲线。


2.5植物根尖分生组织传感器对尿素传感作用的动力学曲线


由图5对电流变化率ΔI呈线性变化的浓度范围做进一步的细分，通过时间电流法测定，用Origin 2019软件分别对得到的参数曲线进行双曲线拟合，得出4种植物准确的受体—配体互作动力学参数[18]，如图6。

图6玉米(A)在10-8~10-4 mol·L-1、辣椒(B)在10-16~10-14mol·L-1、花椰菜(C)在10-19~10-4 mol·L-1和黄瓜(D)在10-20~10-18mol·L-1浓度范围内电流变化率及双曲线拟合

根据受体—配体互作动力学方程

上式为以[RL]为变量的一个双曲线一元二次方程。当[RT]、Kd为固定时，[RL]随[LT]的变化而变化，开始上升地很快，以后逐渐趋向于水平，这就是受体—配体互作的饱和曲线。该式说明了受体与配体的结合具有配体饱和的效应，和米氏酶促反应动力学有相似的特征。于是我们可以获得类似于Km值的重要动力学参数Ka(配体—受体互作所产生的联动变构激活常数)。


从图6可以看出，在较低浓度下，电流的变化率随尿素浓度的增加而增加，表明此时根尖组织上的受体传感能力远高于检测溶液中的配体浓度。当达到一定浓度时，随着尿素浓度的持续增加，电流的变化率基本恒定或变化非常小，表明此时根尖组织上的受体传感能力已达到饱和。上述过程表明，传感器不仅反映了受体与配体的结合，还反映了受体与配体结合后的通过细胞内信号传导和级联放大导致的电化学信号的改变，如离子通道的开启或关闭。