目前，细菌检测方法主要包括传统的微生物培养法(涂板法)及近年来兴起的分子生物学方法，如PCR、基因测序和质谱分析等。但是，上述方法存在如下技术缺点：1)传统微生物培养法存在培养周期长、操作繁琐、易受环境因素影响等问题，且对于一些难以培养的病原微生物无法进行有效检测。2)生化鉴定法则依赖于特定的生化反应，虽然具有一定的特异性，但同样受到操作复杂性和时间成本的限制。3)分子生物学方法通过提取和分析细菌的遗传物质，能够实现快速、敏感和特异的检测。然而，分子生物学方法往往需要复杂的实验操作和高精度的设备，对操作人员的技术水平要求较高，且成本相对较高。


依据电化学检测具有高精度，高灵敏等检测优势，基于电化学微流电子装置(MEMS)已有报道，但目前仍然存在诸多技术问题：1)电化学检测方法选择性较低，通常需要对电极表面进行功能化修饰改性，赋予电化学检测一定的选择性和进一步提高灵敏度/检测线；2)由于微流控装置的一体成型方式和孔道尺寸较小，常规开放式电极表面改性方法无法在狭窄微流孔道内有效实现，限制其表面功能化与发展；3)目前已有报道的微电极表面改性方法有：(i)如通过外加磁场，诱导磁性纳米颗粒在电极表面原位组装，但精度较差(磁场线决定)；(ii)利用光或电刺激响应天然聚合物(海藻酸/壳聚糖等)在电极表面原位组装形成多孔凝胶涂层，其精度尚可，但目前研究主要用于包埋负载功能性填料在电极表面，且针对特殊生物活性分子(如，细胞/细菌/药物分子)经包埋后易导致其失活，且负载率及包封率有限。


公布号为CN113171807A的发明专利公开了一种浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片及其设计方法。其包括浓度梯度分级模块和菌液输送检测模块。所述的浓度梯度分级模块包括依次排列n级混合流道组，n为自然数。混合流道内均设置有多块挡板。各挡板沿着混合流道的长度方向在混合流道两侧壁上交替排列。将传统圣诞树结构浓度梯度芯片的蛇形流道修改为带有交错设置的挡板的直线型流道，可在流道宽度和高度不变的情况下减小流道所占用的面积，并降低加工难度，从而减小微流控芯片的尺寸，并降低加工成本。但是，该微流控芯片针对细菌浓度梯度需要构建出不同的检测通道，通道结构复杂，常规微流通道基材对微生物无明显特异性吸附，且吸附能力较差，所导致浓度梯度变化不敏感或要求更长路径的微流通道，因此对较低细菌浓度样品检测效果极其有限；此外，依赖常规可见光/荧光信号检测方法普遍存在灵敏度/分辨率较低，还需要提前染色或荧光标记处理等技术缺陷。


有鉴于此，有必要设计一种改进的高通量电化学梯度扩散快速检测细菌微流控装置及应用，以解决上述问题。


本发明提供了一种高通量电化学梯度扩散快速检测细菌微流控装置，其为由玻璃基板、壳聚糖/糖蛋白薄膜复合微电极、PDMS层按从下至上的顺序依次进行组合安装而成的MEMS电化学微流检测装置；


所述壳聚糖/糖蛋白薄膜复合微电极包括微电极阵列、负载于所述微电极阵列表面的壳聚糖/糖蛋白薄膜凝胶涂层；所述PDMS层上设置有与壳聚糖/糖蛋白薄膜复合微电极连接的微流通道，用于进行细菌的电化学梯度传感和快速检测；


所述壳聚糖/糖蛋白薄膜凝胶涂层以壳聚糖薄膜为基材，并通过进一步接枝β-D半乳糖单体制备而成，β-D半乳糖单体的接枝率为0.1％～3％。


优选的，所述细菌为铜绿假单胞菌。


优选的，所述微电极阵列为非金属微电极阵列、贵金属微电极阵列中的一种；所述微电极阵列为方形阵列。


优选的，所述贵金属微电极阵列为铂微电极阵列、金微电极阵列中的一种；所述非金属微电极阵列为碳超微电极阵列、碳纳米管微电极阵列、碳纤维微电极阵列中的一种。


优选的，所述壳聚糖/糖蛋白薄膜复合微电极中，所述壳聚糖/糖蛋白薄膜凝胶涂层利用电化学原位沉积法或直接铺膜法组装贴合到微电极阵列表面。


优选的，所述高通量电化学梯度扩散快速检测细菌微流控装置的制备方法，包括如下步骤：

S1，制备壳聚糖溶液；


S2，基于壳聚糖溶液，通过电化学原位沉积法或直接铺膜法，在微电极阵列表面原位构建厚度为100nm～10um的壳聚糖凝胶涂层，得到壳聚糖薄膜复合微电极；


S3，对壳聚糖凝胶涂层进行改性处理，依次进行2-溴异丁酰溴单体接枝反应和β-D半乳糖单体接枝反应，得到β-D半乳糖单体接枝的壳聚糖/糖蛋白薄膜凝胶涂层，由此，得到壳聚糖/糖蛋白薄膜复合微电极；


S4，将玻璃基板、壳聚糖/糖蛋白薄膜复合微电极、PDMS层按从下至上的顺序依次进行组合安装，形成MEMS电化学微流检测装置，用于进行细菌的电化学梯度传感和快速检测。


优选的，步骤S2中电化学原位沉积法的工艺参数为：电压控制在1.0V～5.0V，时间控制在10s～300s。


优选的，步骤S3中对壳聚糖凝胶涂层改性处理的具体过程为：


S31，先对壳聚糖凝胶涂层进行交联处理；然后，于氮气环境下，采用2-溴异丁酰溴为接枝单体，于15～35℃下搅拌6～36h进行溴接枝反应，得到溴接枝的壳聚糖凝胶涂层；


S32，采用β-D半乳糖单体为接枝单体，于氮气环境下置于40～90℃下搅拌2～24h，对溴接枝的壳聚糖凝胶涂层进行β-D半乳糖单体接枝反应，得到壳聚糖/糖蛋白薄膜凝胶涂层。


优选的，步骤S31中所述溴接枝反应的工艺为：依次加入体积比为(1.5～3)：(3～5)：(3～5)：(3～5)的脱水甲苯、三乙胺、2-溴异丁酰溴、脱水甲苯，于20～30℃下搅拌0～12h。


优选的，步骤S32中所述β-D半乳糖单体接枝反应的工艺为：在溴接枝的壳聚糖凝胶涂层中依次加入β-D半乳糖单体、N，N，N，N，N-五甲基二亚乙基三胺、溴化亚铜与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液、水，于氮气环境下置于50～80℃下搅拌6～12h。


优选的，所述混合溶液中，N，N，N，N，N-五甲基二亚乙基三胺、溴化亚铜、N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为：(4～6)μL：(0.001～0.003)g：(100～300)μL。


优选的，所述高通量电化学梯度扩散快速检测细菌微流控装置进行细菌的电化学梯度传感和快速检测的具体方法为：将细菌样品流入微流通道中进行梯度扩散0.5～10min，用于进行细菌的梯度扩散快速检测；清洗后再通入浓度0.1％～8％的葡萄糖溶液，进行微电极阵列的电流信号检测实现对细菌浓度检测，同时通过电流的梯度变化率，对检测结果进行矫正和验证。