细胞内Ca2+，H+与活性氧(reactive oxygen species,ROS)是植物体内广泛存在的响应生物或非生物胁迫、调节植物生长发育的因子。人们越来越倾向认为，这些调节因子所显示的时空动态复杂变化模式是它们信号行为的一部分。因此，检测Ca2+，H+与ROS的动态变化，是研究和了解这些细胞因子对植物起调节作用的关键。然而，上述无机信号分子在细胞内浓度等时空变化的有效检测或监测手段一直较少。目前这些信号的显像技术已经出现，并且可以在细胞和亚细胞水平上对上述信号(分子)进行原位实时定量鉴定。这些显像或成像方法是基于一些小分子染料可以与Ca2+，H+和ROS发生专一性的相互作用、从而使染料荧光特性发生改变的原理。研究进一步发现，使用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)，可以在亚细胞尺度上，对Ca2+，H+和ROS信号分子进行高分辨定位分析。


1 Ca2+在植物活细胞体内的成像


1.1细胞内Ca2+成像分子探针


Ca2+被认为是广泛存在的细胞功能调节子，因此人们十分关注这种阳离子在细胞内的时空变化水平，以期揭示出它是如何触发细胞生理响应的。细胞质Ca2+水平常常呈现出诸如“尖峰形成”和细胞内“钙波”形式的变化、被认为是细胞间触发信息传递的方式。解码Ca2+“指纹”的生物化学耦联，使得Ca2+信号能够参与细胞对多种环境刺激响应的调节。Ca2+浓度过高时、它也是一种细胞毒素，在胞质中其浓度为100 nM水平、而在细胞器内或质外体Ca2+浓度大致在在1 mM水平。在细胞质中，一旦Ca2+浓度超出100μM水平时间过长，细胞功能将会因Ca2+沉积而遭到破坏。然而，Ca2+浓度在100μM水平上的增加，如果在时空上受到限制，细胞是可以耐受的。最典型的是植物根尖生长点和伸长区细胞。因此，对Ca2+浓度动态变化模式的监测是研究Ca2+信号的关键。然而，Ca2+浓度瞬时变化的定位与成像却面临诸多挑战。因为监测细胞质Ca2+浓度的系统必须足够灵敏、而且能够检测到100μM浓度范围Ca2+的变化、并且要避免其他二价离子如Mg2+的干扰。


广泛用来进行植物细胞Ca2+显像的染料，都含有一族碳酸残基。这些染料通过碳酸残基与Ca2+相互作用，使得其自身的荧光强度发生改变。例如，Ca2+荧光染料Green-1，Ca2+浓度从0到μM水平上的变化，可以使其荧光染料发光强度增加上百倍(图1)。可以借助激光共聚焦或荧光显微镜，用肉眼观察Ca2+染料荧光强度的增加，进而推断Ca2+浓度水平的变化。一旦知道Ca2+探针的解离系数，可以用简单的公式来确定Ca2+浓度变化：


Ca2+浓度=Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]


上式中Kd为Ca2+对Ca2+染料的解离系数；F是测定的荧光强度；Fmax是饱和荧光强度；Fmin是无Ca2+时的荧光强度。


在使用以上描述过的方法过程中，人们发现荧光共振能量转移(Fluorescent resonance energy transfer，FRET)，这一基于Ca2+绿色荧光受体蛋白(green fluorescent proteins，GFPs)的转基因新技术，对于信号检测来说是很有吸引力的一项新技术。Palmer等分析研究了荧光共振能量转移等成熟的技术方法，在实践中有很强的应用价值。


1.2向植物细胞内加载Ca2+染料的方法


能与Ca2+相互作用的染料，均含有强烈的带电基团、使得它们不易进入细胞。因此，要使Ca2+染料顺利进入植物细胞，确实是个不小的挑战。使细胞膜可逆性溶解或撕裂的技术，如电穿孔、去污剂增溶、微注射、膜片钳、颗粒型传送、或其它酸酯掩盖电荷的方法，均可使染料顺利进入植物细胞。值得一提的是，染料在胞质和细胞器内加载积累后、保持其完整性十分重要。因此，目前与葡聚糖相结合的染料分子、经显微注射加载进入细胞的方法受到广泛重视。

图1 Ca2+敏感的荧光染料和绿色荧光蛋白的特性


(a)Ca2+传感染料Calcium Green-1，Fura-2和Indo-1荧光发射与激发波普。这些染料的化学结构如下：(i)Ca2+结合后荧光强度增加的波长，(ii)Ca2+结合后荧光强度不同步增加的辐射波长，(iii)Ca2+结合后荧光强度下降的波长。(b)彩色表示波普的范围。(c)Ca2+响应的Ca2+传感蛋白：钙调素(calmodulin)结构域在2个Ca2+结合的能量转移伴侣蛋白CFP和YFP之间；钙调素结合Ca2+后，蛋白构象的改变使得CFP与YFP接近、FRET出现后导致激发态光产生。(d)Ca2传感蛋白的荧光发射波普。Ca2+水平增加,CFP(FRET供体)辐射减弱,而YFP(FRET受体)辐射增加。缩略语：青色荧光蛋白CFP,cyan fluorescent protein；荧光共振能量转移FRET,fluorescence resonance energy transfer；黄色荧光蛋白YFP,yellow fluorescent protein。