目的是检测运动前后大鼠血液及各组织H2S含量以及各个组织生成酶活性，分析运动后各组织H2S含量及其生成酶活性的变化特点。以雄性SD大鼠为实验对象，采用敏感硫电极法检测大鼠心脏，肾脏，肺，肝脏，骨骼肌，脑等组织H2S含量，对结果进行相关性分析。雄性SD大鼠16只，随机分为2组：对照组、运动组。运动组大鼠做连续1小时的一次大强度性负重（10%体重）游泳运动，运动后即刻对大鼠取心脏，肾脏，肺，肝脏，脑组织、腓肠肌、腹主动脉血进行分析，采用敏感硫电极法测定各组织的H2S含量及其生成酶活性；对照组大鼠直接取样测定。经运动后与对照组相比除大鼠脑组织H2S含量明显降低外，运动组大鼠各组织系统H2S含量较对照组有大幅度升高。经运动后与对照组相比除大鼠脑组织H2S生成酶活性略有降低外，运动组大鼠各组织H2S生成酶活性较对照组均有不同程度的升高，尤以心脏、肺脏组织有大幅度升高。敏感硫电极法测量范围广，敏感性强，稳定性和重复性均良好，可应用于大鼠脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、骨骼肌H2S测定的研究，但在测试血浆H2S含量时精确度略显不够。经一次性大强度运动后，与对照组相比大鼠心脏，肺脏，肝脏，肾脏，骨骼肌器官的H2S/生成酶体系均有不同程度的提升。运动使内源性一氧化氮升高从而造成H2S/生成酶体系的升高。一次性大强度运动可增加各个组织无氧代谢酶活性，推测一次性大强度运动使机体无氧代谢酶活性的升高与H2S/生成酶系统活性的上升有着必然联系。大鼠运动后脑组织H2S/生成酶系统活性降低的原因还不是十分清楚，推测测定时大鼠脑组织中的硫化氢生成酶胱硫醚—β—合酶(CBS)还未合成。大鼠血浆硫化氢浓度变化趋势同大鼠其它组织，验证了血管平滑肌CSE在大鼠运动后的表达同其它各组织。


据20世纪90年代以来的研究发现，内源性产生的H2S存在于哺乳动物的多种组织、器官,通过多种调节方式和信号转导形式发挥多种生理、病理作用，可松弛血管及消化道平滑肌，进而影响该组织的生理功能和病理过程;选择性地增强N-甲基–D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的反应,并改变对海马的长时程增强(LTP)作用的诱导(海马的LTP是一个有关学习和记忆的突触模型),从而影响大脑的发育;调节下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)释放抑制由内皮素诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖效应进而调节血管平滑肌细胞张力,可能起内源性气体信息分子的作用。由对其生理作用的研究,提出了H2S是一种新型的、具有类似氧化亚氮(NO)和一氧化碳(CO)某些特征的分子,如H2S是一种小分子量的气体分子、不通过受体发挥作用、其生成受内源性关键酶的调节、生理浓度时有很明确的特殊作用等,因此,将其归为第3类内源性气体信息分子，从而开辟了对H2S认识、研究的新领域。


越来越多的资料表明，H2S广泛参与机体多种生理和病理过程，可对机体心血管、神经、代谢、消化、免疫、血液等系统进行调节。目前检测H2S及其生成酶的方法主要有两种，即亚甲基蓝比色法和敏感硫电极法。


亚甲基蓝比色法是检测H2S及其生成酶的经典方法，为多数研究者所采用，但与新兴的敏感硫电极法相比，其检测敏感性较差。有关内源性H2S和运动系统的研究尚未见报道，但有研究显示，人体在运动时吸入一定浓度外源性H2S后，骨骼肌乳酸脱氢酶活性增加、有氧氧化酶活性呈不同浓度降低，猜测H2S作用于人体后通过抑制肌肉运动时有氧代谢，降低人体运动过程中的氧摄取，从而增加人体在运动过程中依赖无氧代谢的能力，提高机体的适应能力。但其目前的研究也仅针对少数几种哺乳动物、有限的几种器官、系统。由于对H2S根深蒂固的毒性认识,限制了对其在生物体内的生理作用、调节机制、病理生理等方面作用机制的进一步研究。虽然目前的研究范围和领域在不断地扩大,仍远未达到对其本质的认识,这就有待我们在今后的工作中不断地进行探索。


本文通过设定运动刺激因素，检测运动后大鼠心脏、肾脏、肺、肝脏各组织H2S含量及其生成酶活性，分析运动后各组织H2S含量及其生成酶活性的变化特点，并对H2S及其生成酶系统影响运动后各组织机能变化的可能机制进行初步探讨，对大鼠运动前后各器官系统的硫化氢与生成酶含量进行比较以研究运动对其机体内源性H2S含量的影响。


1材料与方法


1.1研究对象


健康雄性Spraque Dawley（SD）大鼠16只，体重175-208g,购自北京大学医学部，国家标准啮齿类动物饲料，合笼饲养，自由饮食，室温20-25℃，相对湿度30-50%，保持12小时光照。


1.2研究方法


1.2.1实验法


1.2.1.1实验原理


实验原理依据耿彬等研究结论：体液内H2S主要以两种形式存在，即物理溶解的H2S气体（约占1/3）及化学形式存在的H2S（约占2/3），其化学特性呈弱酸性，在强酸条件下，HS-与H+结合生成H2S（公式1），从体液中挥发，但物理溶解部分不能析出，在强碱条件下，H2S和HS-与OH-结合形成比较稳定的S2-（公式2，3），采用第三硫电极可以精确测量溶液中S2-的浓度，利用这一原理，我们采用第三硫电极，测定溶液中S2-，间接反映H2S的浓度。公式1：HS-+H+→H2S；公式2：2HS-+2OH-→S2-+2H2O；公式3：2H2S+2OH-→S2+2H2O。


1.2.1.2仪器与试剂


仪器：小型三用水浴箱（北京西城区医疗器械厂1505型）。精密酸度计（上海理达仪器厂PHS-2C型），银硫离子选择性电极（上海雷磁仪表仪器有限公司pAgS-1型），硫化氢电极（丹麦Unisense公司），离心机（80-2离心沉淀器）。


试剂：5’-磷酸吡哆醛为Fluka产品；其余试剂均为国产分析纯试剂。


1.2.1.3指标测试与方法


测试样本的采集与处理：（1)大鼠称重，实验组行游泳力竭运动，力竭判断标准:大鼠挣扎动作消失，沉入水下大于10S，捞出后平放无法完成翻正反射。（2)实验组力竭后先行用2%戊巴比妥钠按0.25ml/100g体重腹腔注射麻醉，腹主动脉取血后，速取左侧腓肠肌、心脏（去除结缔组织）；肝脏，脑组织，肺脏，肾脏，用锡纸包叠、标记后冻存待测。对照组直接进行步骤（2）处理。


称取各个组织样品，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，以1:9（W/V）的比例加入匀浆液进行匀浆。匀浆液为50mmol/L磷酸钾缓冲液（K2HPO4·3H2O，KH2PO4，pH6.8）。离心，取上清保存待测。


1.2.1.4组织硫化氢生成酶活性的测定


抗氧化液配制：氢氧化钠（NaOH）8g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）7g，去离子水85ml，抗坏血酸10g。要求现用现配。标准S2-溶液配制：硫化钠（Na2S·9H2O）0.2402g，去离子水1ml，配制成1mol/L标准溶液，再加入等量抗氧化液。要求现用现配。


离子测定程序：①使用前，先将银硫电极浸入去离子水中活化4h左右，再用抗氧化液活化90min左右；②打开酸度计电源，将测定项调至mV档，预热15min以上；③将敏感银硫电极与参比电极一起浸入样品中，待读数稳定后记录；④用去离子水冲洗电极；⑤每测一个样品结束，电极必须浸入去离子水中以保持其活化状态；⑥每次测定前均应使用标准S2-溶液用抗氧化液稀释成所需浓度做标准曲线。


（1）大鼠冻存组织0.2g,以1：9（质量体积比）用预冷的50mmol/l磷酸钾缓冲液（PH=6.8）1.8ml在手动匀浆器制备10%（W/V）组织匀浆。离心机离心，取上清液。（2）取组织匀浆液和反应液加入反应瓶：(总反应体积的终浓度：100mmol/l磷酸钾缓冲液（PH=7.4）、2mmol/l左旋半胱氨酸、2mmol/l磷酸吡哆醛)

总反应体积2ml4ml5ml 10%组织匀浆液0.2ml0.4ml0.5ml 0.2 mmol/l左旋半胱氨酸0.02ml0.02ml0.05ml 0.05%磷酸吡哆醛1.78ml1.78ml4.45ml


（3）反应瓶中小烧杯内加入0.5ml 1mol/L NaOH，用双层石蜡膜迅速封口；（4）应瓶置于37℃水浴箱孵育90min；（5）揭开石蜡膜，加入0.5ml 20%三氯乙酸，迅速封口，37℃水浴孵育60min终止反应；（6）取出小烧杯内液体用敏感硫电极法测定溶液中的H2S含量；（7）采用酸度计测定溶液中的电压（mV）值；（8）利用标准曲线（使用标准S2-溶液用抗氧化液稀释成40、80、100、1000、10000µmol/L溶液做标准曲线）计算S2-浓度，再计算H2S生成酶，结果以nmol/min·mg(protein)表示。


1.2.1.5组织硫化氢含量的测定


抗氧化液配制、标准S2-溶液配制、离子测定程序如前述。（1）取上述10%组织匀浆液0.5ml加入反应瓶（100ml锥形瓶，其中放置一个5ml小烧杯）；（2）加入0.5ml 1mol/L HCl，使组织H2S释放；（3）反应瓶中小烧杯内加入0.5ml 1mol/L NaOH，以吸收H2S，用双层石蜡膜迅速封口；（4）将反应瓶置于37℃水浴箱孵育4h；（5）取出小烧杯内液体，加入0.5ml抗氧化液；（6）采用酸度计测定溶液中的电压（mV）值；（7）利用标准曲线（使用标准S2-溶液用抗氧化液稀释成1、10、20、40、80、100µmol/L溶液做标准曲线）计算S2-浓度。组织H2S含量以nmol/mg(protein)表示。


1.2.1.6血浆硫化氢浓度的测定


（1）取血浆1ml,加入等体积的抗氧化液；（2）采用离子计测定S2-含量；（3）具体操作：将敏感硫电极与参比电极一起浸入样品中，待读数稳定后记录测定值，然后根据S2-溶液标准曲线计算硫化氢含量。H2S含量以nmol/mg(protein)表示。


1.2.2数理统计法：利用SPSS软件对数据进行统计分析。



运动前后大鼠脑组织硫化氢含量与生成酶活性变化（一）

运动前后大鼠脑组织硫化氢含量与生成酶活性变化（二）