研究简介：木质纤维素(cellulose)是由葡萄糖组成的大分子多糖。不溶于水及一般有机溶剂。甲壳动物蛀木水虱危害木船和码头木质设施，俗称“吃木虫”。研究发现蛀木水虱有一定的益处，其体内含有一种特殊的酶，有助于将木头分解为生物能源。蛀木水虱体内并没有帮助消化木质的微生物，研究人员发现完全靠自己将木质纤维素分解为糖分。本论文主要就甲壳动物蛀木水虱中存在的血液蛋白酶如如何实现对木质纤维素的消化，了解其体内存在的蛋白酶对纤维素水解的机理，从而将有助于科学家们设计出更强大的酶用于工业生产。


Unisense微电极系统的应用


unisense公司的pH电极和氧气微电极应用于动物肠道内的pH测试及氧浓度的测试。实验过程中，蛀木水虱用针刺头和针固定在琼脂糖板上(上覆有海水)。在镊子的帮助下，切除蛀木水虱胸椎节段，露出了蛀木水虱后肠，使用尖端直径为25μm的pH值微电极和尖端直径为10μm氧气微电极(Unisense、丹麦)对蛀木水虱的上肠腔到后肠腔内的氧气和pH进行了测试。传感器尖端被引入信号稳定后记录下肠组织内部不同区域的pH值和氧浓度值。


实验结果


木质(木质纤维素)植物是一种丰富的可再生原料，富含多糖与木质素结合成不溶性纤维的复合材料。海洋甲壳类动物林栖动物属的伐木工是少数能以这种食物为生而不依赖肠道寄生菌群的动物之一。粪便颗粒分析说明蛀木水虱以含己糖的多糖(主要是纤维素)为目标与消化系统中纤维素酶的丰富程度相对应，但是木兰和木质素基本未被消耗。研究证明了蛀木水虱的呼吸蛋白，血蓝蛋白，在木材被消化的后肠中含量丰富，与木材一起孵育血蓝蛋白通过纤维素酶显著提高其消化率，并对木质素进行了修饰。我们提示血蓝蛋白的这种活性对蛀木水虱的摄食能力是有帮助的没有肠道共生体的木材。这些发现可能会带来创新木质纤维素生物炼制。

图1、柳树木主要生物高分子组成成分的消化前后。图a表示的是蛀木水虱的粪便颗粒扫描电镜(尺寸-50μm)。b从木材(柳树，N=10)和粪球(粪便78%，为消化过程中的质量损失，N=8）组分包括乙酰溴化的可溶性木质素(蓝色)、TFA-可溶性半纤维素(红色)和硫酸酸性的可溶性纤维素(橙色)。图c表示的是木材纤维素组分消化前(柳树,N=11;(暗橙色)的单糖组成(绝对含量）和消化后(粪便78%，消化过程中归一化的质量损失，N=8;淡橙色)在使用三氟乙酸（TFA）水解后，连续H2SO4水解进行的分析。d木材半纤维素组分单糖组成(绝对含量)(柳树N=11;消化后(粪便78%，归一化为消化过程质量损失，N=10;淡红色)TFA水解分析。圆圈表示样本值。Fuc,海藻糖,Ara,阿拉伯糖;Rha,鼠李糖;半乳糖;Glu、葡萄糖;Xyl,木糖;,甘露糖;GalA,半乳糖醛酸。

图2、蛀木水虱的消化系统组成示意图。图a表示的是蛀木水虱侧面示意图(通常2-3mm长)，图中显示两个双叶肝胰酶(Hp)中的一个，连接了管状肠的前部;流形(M)和过滤系后统(FS)位置如图所示，后肠部分食物质量为暗色，肠道不同测量位置点的pH值。B肠道的几丁质角质层内衬的扫描电子显微照片(比例尺寸、5μm)。图C表示的是脾肝胰腺细胞微绒毛(Mv)的肝胰腺内腔的透射电子显微照片(比例尺寸,2μm)。图D表示的是应用微电极测试蛀木水虱后肠(肠)区域，蛀木水虱身体区域及进入周围加入的海水中的氧浓度(尺寸的规模0.5 mm)。

图3、蛀木水虱消化过程蛋白质的转录和天然血青素提取物。图a表示的是蛀木水虱后肠液中糖基水解酶(GH)家族相对丰度的测定。图b表示的是蛀木水虱的后肠血青蛋白相对丰度通过血青蛋白相对摩尔百分比的比较，分为组织(包括固体含量)和液体部分。图c表示的是从蛀木水虱克隆的GH家族5、7、9各2个成员的相对基因表达差异。图d表示的是蛀木水虱内的4个血青蛋白基因的相对表达差异。图e表示的是蛀木水虱体内的血蓝蛋白的凝胶（SDS-PAGE）电泳图。图f表示的是经阴性醋酸铀酰染色的天然蛀木水虱中血蓝蛋白的提取物的TEM图像显示。

图4、焦糖醇和分离木质素的血青苷活性。图a表示的是变色菌属虫漆酶与活化的在以NaPO4、pH为6.8，含有1nm的焦棓酸培养孵化的血蓝蛋白的紫外-可见光谱图。图b表示的是碱木质素(3%)在海水(SW，黑色)或含血蓝蛋白(Hc，红色）经1h孵育后的13C固相核磁共振13C谱图。

图5、室温下短血蓝蛋白预处理后杨柳树木的消化率。其中杨柳消化率测定采用的是生物量预处理糖化反应中每单位生物量释放纤维二糖(nmol)的量(mg)。预处理包括在海上中对血蓝蛋白的预处理（Hc暗红色）、单独的海水处理（SE淡蓝色）、没有处理（蓝色）和使用了50mM DTPA（螯合剂）处理（淡红色）。图b表示的是应用CBH I进行糖化后的红褐肉座菌(HjCBHI)。水解产物是根据分析HPAEC中纤维低聚物标准。所获得的数值是对预处理后没有CBH的反应进行归一化，来反映血青苷的制备过程中剩余的纤维素酶活性。


结论与展望


英国约克大学、朴次茅斯大学以及美国国家可再生能源实验室的科学家使用先进的生物化学分析方法和微电极技术，找出了蛀木水虱体内能分解木头的酶并揭示了其结构和功能。在研究过程中，研究人员为了充分了解蛀木水虱体内蛋白酶分解木质纤维素的的机理，应用unisense公司的氧气及pH微电极成功实现了对甲壳动物蛀木水虱体内的肠道组织内的氧气及pH实现了原位的测试，由于该微电极具有空间精度高（尖端直径为25um或10um）、测试相应速度快（2s），很好的帮助科研人员对活体的甲壳动物蛀木水虱体内的相关环境（pH/氧浓度等）进行了原位测试，从而更好的了解蛀木水虱体内存在的这种分解木质纤维素酶的工作原理，很好的揭示了其结构和功能，成功的揭示了纤维素链如何被消化成葡萄糖。该研究结果将有助于科学家们设计出更强大的酶用于工业生产，这说明微电极在研究关于地将废纸、旧木材和稻草等废物变成液体生物燃料领域存在很好的应用前景。