创伤伤口的局部氧浓度长期以来被认为是创伤愈合的一个重要参数。伤口附近的组织氧合与伤口愈合是呈正相关，而在无法愈合的伤口周围的氧含量往往很低。而目前对生物膜与伤口延迟愈合有关生物膜会损害伤口愈合的机制尚不清楚。由于许多种类的细菌产生外毒素和外酶可能抑制伤口的愈合。由于伤口处存在的生物膜和反应的白细胞会消耗氧气，这可能会阻碍伤口愈合，而伤口愈合本身又需要氧气。本论文的研究人员使用了氧微电极传感器用来测量通过体外培养的糖尿病(db/db)小鼠创面模型的生物膜氧的横断面进行了研究，试图验证假设细菌的生物膜的建立是否有助于维护伤口局部低氧张力。


Unisense微电极系统的应用


氧气微电极传感器由一个标准电动推进器级进行控制的。氧气微传感器在使用前至少预极化5小时，并在使用前立即进行两点校准。氧气微电极应用于活老鼠身上的固定伤口结痂处的氧浓度剖面测试，氧微电极微传感器测量开始于老鼠的皮肤上的痂或伤口上方的空气中，然后将微传感器穿刺老鼠的痂或伤口中进行氧分压的测试。


实验结果


应用氧气微电极传感器测量体外培养的糖尿病(db/db)小鼠创面模型的生物膜的横断面氧分压浓度，结果表明小鼠痂内创面的氧分压含量较高，在活的老鼠的体内出现一个陡直氧的的梯度浓度范围从17到72毫米汞柱之间。被安乐死的老鼠身上氧的浓度范围为从6.4毫米汞柱到1.1毫米汞柱。小鼠痂内的氧梯度与体外培养的临床分离株以及体外培养的人体标本相似。在同步对小鼠痂内的假单胞菌的代谢活动的特征进行了转录组学分析，结果表明细菌代谢活性相关的表达基因与细胞生长有关。转录组的结果也表明伤口内的细菌经历了限氧应激效应。在体内表达的细菌基因是与细菌相关的是Anr介导的缺氧应激反应基因。其他细菌应激反应基因与静止期生长相关的基因在体内高表达，渗透应力和RpoH介导的热应激效应。这也说明细菌生物膜是能促进慢性伤口愈合是通过维持局部低氧张力，它们本身的新陈代谢活动则是通过补充消耗氧气的细胞来完成宿主的防御过程。

图1、人慢性创面分离标本在体外形成的细菌生物膜中氧浓度分布。深度标度为零是自自行设定的（位于生物膜的上方），微电极传感器的测量始于生物膜的上方，然后将微传感器放入生物膜中。当微电极传感器穿透生物膜时，生物膜内的氧浓度开始下降。每个剖面文件是在三到四组独立的测量数值，误差范围表示与平均值的标准差。生物膜是由绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、GDE、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等组成的。不论生物膜的种类组成如何，都测量了相似的生物膜的氧浓度剖面。

图2、小鼠完整创面痂的氧浓度分布。伤后2天感染铜绿假单胞菌生物膜。深度标度为零是自行设定的，氧气微电极传感器测量开始于痂或伤口上方的空气中，然后将微传感器穿刺入痂或伤口中，氧浓度开始下降，因为微传感器渗透到痂或伤口中。(A)两种不同活鼠的伤口痂的氧浓度剖面图。(B)两只不同安乐死的小鼠伤口痂的剖面图。(C)活鼠除痂后伤口氧的浓度剖面图。(D)活老鼠背部新伤口的氧浓度剖面图。创面痂表面具有与体外生物膜相似的氧梯度分布。

图3、小鼠伤口的氧浓度梯度分布，在(◆)微波加热前或微波加热后(■)，痂在体外被探测对应的氧浓度剖面。深度标度为零是任意微传感器测量的从痂上面的空气中开始的位置，然后微传感器穿刺入痂或伤口内，当微传感器穿透未加热的痂皮，氧气浓度开始下降。伤口从小鼠身上去除痂皮后，痂皮仍保持氧梯度。通过加热结痂处消除的氧梯度，说明存活的细菌是维持伤口处生物膜的氧梯度的必要条件。

图4、人体清创术标本伤口氧浓度分布。深度标度上的零是任意的在，对应是微传感器的测量开始于样品上方的空气中的位置，然后将微传感器穿刺入样本中。氧浓度作为微传感器开始下降则是氧微电极已经穿透了伤口标本。每个氧浓度的剖面的平均值是三到四次独立的测量的平均值。样本H13来自一名糖尿病患者足溃疡，样本H14来自一个神经病脚趾溃疡。人类的伤口和实验小鼠创面观察有类似的氧气梯度体外生物膜。

图5、微阵列数据的主成分分析集。采用了PCA对小鼠分组进行可视化伤口痂微阵列数据(■)比较发布参考数据集。所有使用假单胞菌菌株PAO1，包括浮游生物的研究，连续生长流动生物膜反应器和从活动顶部(△)的标本获得的24个完整的生物膜，且属于活动较少生物膜菌落(△)，还包括在小鼠伤口模型中的菌落生物膜制剂用作接种剂。


总结


慢性伤口从字面上讲就是外伤后或自发破溃后长时间无法愈合的伤口，而表皮更新能力降低的原因其实就是慢性伤口形成的原因，可分为全身因素和局部因素。全身因素包括高龄、营养不良、糖尿病、长期使用激素（皮质激素）、全身严重感染、全身化疗、某些自身免疫性疾病。本论文的研究人员从慢性伤口表面存在的细菌生物膜的缺氧与伤口愈合之间的关联性进行了相关研究，通过使用unisense氧微电极传感器对体外培养的糖尿病(db/db)小鼠的创面模型的生物膜横断面区域的氧的浓度进行研究，由于unisense微电极的尖端通常都比较细（10-100um），可以穿刺人小鼠的慢性伤口处形成的细菌生物膜内的氧的分压浓度进行测试，测试的结果表明小鼠痂内创面的氧含量较高，在活体老鼠出现一个陡直氧的的梯度浓度范围从17到72毫米汞柱之间，被安乐死的老鼠身上氧的浓度范围为从6.4毫米汞柱到1.1毫米汞柱，这也证明了慢性伤口处的细菌代谢活性相关的表达基因与细胞生长有关的，由于使用的氧气微电极能够准确的测试出伤口处的细菌生物膜表面的氧分压的梯度分布，研究人员得出了关于慢性伤口处的细菌生物膜能促进慢性伤口愈合是通过维持局部低氧张力实现的机制，这说明氧气微电极在医学关于皮肤慢性伤口愈合的相关机制研究方方面具有很好的应用前景。