植物的茎尖分生组织(SAM)是一个多层次的特点结构，也是植物体地上部分各种组织结构的基础，并且对于生产地面上的植物组织起着重要作用复杂的多细胞生物是在地球上大气的富氧环境中进化而来。维持植物干细胞的多能状态需要低氧条件下，而高氧张力会促进植物细胞分化。为了证明此观点，本论文的研究人员利用基因报告和体内氧气测量相结合的方法，研究发现植物芽的分生组织能够在低氧生态位中发育，并且应用低氧条件来调控新叶子的产生。研究人员使用了一种微型的克拉克式氧电极，它的微型探头足够薄，可以在微米分辨率下测量植物组织内氧的水平。通过茎尖的纵向和径向测量表明，在与干细胞生态位广泛重叠的区域，氧的浓度急剧下降，从而揭示了SAM组织周围低氧生态位的存在。


Unisense微电极系统的应用


克拉克型氧气微传感器(Unisense)测量植物尖端组织内的O2浓度分布。氧气微电极的尖端直径为3um，相应时间小于1s。氧气微电极在测量前后分别在0.1M的NaOH中加入抗坏血酸钠(0%O2饱和度)和空气鼓泡水(100%O2饱和度)进行线性校准。氧气微传感器安装在微操作器控制台上(MM33-2)上，并连接到主机上，氧气微电极以10um的步径穿刺进入植物尖端组织处，测试植物尖端组织内不同位置区域对应的氧分压值。


实验结果


研究人员利用基因报告和体内氧气测量相结合的方法，研究发现植物芽的分生组织能够在低氧生态位中发育，并且需要低氧条件来调控新叶子的产生。研究人员证实了定位于茎分生组织的缺氧抑制N-degron-pathway底物被称为ZPR2，该底物进化为控制iii类同源域-亮氨酸的拉链转录因子s6-8的活性，从而调控分生组织的生长。研究结果显示，氧气是一种扩散信号，在有氧条件下参与控制植物生长过程中的干细胞活性，这表明空间上的氧气浓度差异的分布会影响植物的生长。在分子水平上，这个信号是通过N-degron途径被翻译成转录调控，从而将植物代谢活动的控制与植物发育的调控联系起来。

图1、植物的茎尖分生组织（SAM）活性的保持需要一个低氧生态区域。图a表示的是通过微电极沿植物茎尖组织的顶头方向测试SAM区域的氧浓度变化，图中的颜色代表的是单次测试。图b表示的是拟南芥花序分生组织中GFP的表达受缺氧反应启动子(pHRPE)的驱动。图c表示的是在常规氧条件下和高氧条件下生长的植物的表现。图d表示的是在常氧和高氧条件下生长的拟南芥叶片起始速率.

图2、拟南芥与植物茎尖处的低氧水平区域。图a表示的是空间分辨率比较以及使用的定制克拉克式微传感器（尖端为3微米）(红色，橙色和粉色三角形)与商业可用的传感器OX10,Unisense A/S(青绿色、青色和钴蓝色圆圈）图b表示的是测量植物茎尖处组织内的氧气浓度曲线的实验装置示意图。(左):从顶部到基底方向(左)和径向方向(右)。图c表示的是生长了四天的拟南芥幼苗顶端氧浓度分布。图d表示的是对应图c中的氧剖面重建后的传感器插入模式的跟踪示意图。图e表示的是将克拉克型微电极插入生长七天的拟南芥的SAM处组织的横向不同位置处获得的氧浓度剖面。茎尖区域(剖面曲线1)，子叶血管系统的交界处(剖面曲线2)和接口处以下（剖面曲线3）.图f表示的是通过光学显微镜确定微电极的插入点的位置。

图3、植物茎尖低氧条件下诱导分子缺氧反应研究。图a表示的是一种由5个重复的HRPE报告基因组成的合成结构对氧的响应性。图b表示的是pHRPEx5:GFP-GUS基因在21%、10%和5%O2下的对应的相对染色强度的定量分析。图c表示的是pHRPEx5:GFP-GUS基因在21%和80%O2下的对应的相对染色强度的定量分析。此研究结果表明，该结构能有效地反映植物组织处的氧状态。图d表示的是采用RT-qPCR检测缺氧诱导基因的表达。

图4、a)使用氧气微电极穿刺入5周龄的拟南芥的植株的花序分生组织处的氧浓度剖面，其中微电极是从植物茎尖的顶端到基部的区域插入的。插图显示了微传感器插入植物花序分生组织内的实验装置照片。图b表示的是pPCO1:GFP-GUS和pPCO2:GFP-GUS对缺氧有特异性反应的研究，pPCO1:GFP-GUS被转化为植物的花序和花分生组织中的绿色荧光信号。

图5、植物茎尖区域低氧生态区域是植物的一个共同特征。图a表示的是采用定制的clark型微传感器（unisense），从顶端到基部测量了1周龄的白花蛇舌草茎尖的氧含量。从图中测试数据可以看出这种植物的茎尖存在氧梯度分布。图b表示的是微电极插入番茄叶茎尖组织（SAM）处的图片。图c,d表示的是FM4-64膜染色后的氧剖面(a中c和d分别为青色和红色)和SAM组织显微图的重叠图，图中显示了微电极传感器的实际穿透情况。图c和图d是实验四次后输出的两个实际实验数据图。


总结


植物的茎尖分生组织(SAM)是一个多层次的特点结构，其中一个中央区域专门用于维护干细胞的身份和外围区域产生了新的螺旋组织。原基产生的空间协调(称为分叶性)是通过极性生长素转运来协调的，而对这一过程的时间模式(称为塑化体)的调控则不那么清楚。氧是一种高度反应的可扩散的分子，它保留着根据代谢需要调整发育模式的显著潜力。然而氧气水平在SAM中的作用还没有被准确的评估，因为这个组织由一小群密集的被发育中的原基层包围的细胞构成。本论文的研究人员使用了一种微型的克拉克式氧电极（unisense），它的微型探头非常薄（尖端直径为3微米），可以在微米分辨率下测量植物组织内氧的水平。通过茎尖的纵向和径向测量表明，在对与干细胞生态位广泛重叠的区域测试发现该区域的氧的浓度急剧下降，从而揭示了SAM组织周围低氧生态区域位的存在。从以上研究内容来看，unisense微电极在研究植物组织内的氧浓度方面具有很好的应用前景，为相关研究人员探索植物茎尖分生组织的低氧生长机制的研究提供了重要的技术支持。