在自然界中，细菌常以细菌生物膜的形式存在，其形成给公共卫生、医疗、环境等关乎国计民生的重要领域带来了诸多不利影响。开发细菌生物膜的高效检测方法、探究细菌生物膜形成与细菌群体感应(QS)调控的内在联系，寻找抑制细菌生物膜形成的有效策略，已经成为国内外研究学者广泛关注的热点。本论文针对细菌生物膜实时原位监测、细菌生物膜QS现象实时追踪的研究需求，研制了集成荧光、电阻抗、SERS各种检测功能的光电传感检测芯片。通过在芯片上构建细菌生物膜生长微环境，利用建立的光电传感芯片分析检测方法，实现了细菌生物膜生长状态、形成周期规律、分泌QS信号分子动态变化过程的原位、实时、在线监测与高效分析，进一步探究了传统抗生素、中药活性组分、纳米抗菌材料多种类型抗菌药物对细菌生物膜形成及QS信号分子分泌的影响。


本文主要研究工作及结果如下:


(1)微流控芯片上Tannin-Ag NPs抑制大肠杆菌生物膜过程的原位荧光观测设计制备了用于细菌生物膜实时荧光观测及检测的多通道微腔阵列PDMS-玻璃复合芯片，建立了细菌生物膜可视化荧光分析检测方法。制备了平均粒径为42.37nm的中药活性组分单宁酸与纳米银的复合纳米抗菌材料—单宁酸修饰纳米银(Tannin-Ag NPs)，其对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为16μg/m L。在芯片上通过实时荧光观测及荧光定量检测，考察了Tannin-Ag NPs对大肠杆菌生物膜形成过程的抑制效果。结果表明，1/2MIC的Tannin-Ag NPs强烈地抑制了大肠杆菌生物膜形成，抑制作用强于相同浓度的单宁酸和Ag NPs。Tannin-Ag NPs改变了大肠杆菌生物膜形成的固有周期，使芯片中大肠杆菌生物膜生长期由15 h缩短至9 h。


(2)大肠杆菌和沙门氏菌生物膜形成过程的原位无损电阻抗芯片传感监测设计制备了集成叉指微电极的电阻抗传感芯片，建立了区分大肠杆菌和沙门氏菌生物膜形成过程周期节点的阻抗分析方法。利用集成在芯片底部的叉指金微电极，以100 m V的扰动电压，在1～100 KHz的频率范围内，对这两种细菌生物膜在芯片中的生长变化过程进行了长达48 h的原位阻抗监测。采用包含生物膜电容C_b及生物膜电阻R_b等关键参数的等效电路分析模型，解析了这两种细菌生物膜的阻抗谱图。结果表明，随着培养时间的延长，C_b呈先下降后上升的趋势，而R_b却呈现出与C_b相反的变化趋势，这与细菌完成电极表面粘附并逐渐形成成熟生物膜，直到细菌生物膜出现散播的变化过程密切相关。此外，沙门氏菌及大肠杆菌的C_b及R_b发生改变的时间节点存在差异，可通过阻抗检测方法对这两种细菌生物膜形成过程进行区分。最后，采用结晶紫染色法证实了阻抗传感芯片分析方法解析细菌生物膜形成过程的正确性。


(3)铜绿假单胞菌生物膜形成过程中电活性QS信号分子的芯片传感监测。设计制备了用于铜绿假单胞菌生物膜形成过程中分泌绿脓菌素原位、实时监测的电化学传感芯片。在芯片上集成了由工作电极、参比电极和对电极组成的微电极阵列。采用电化学沉积法在工作电极表面修饰了粒径大约为100 nm的纳米金颗粒。电化学传感芯片对绿脓菌素检测限低至100 n M，在100 n M～200μM范围内绿脓菌素浓度与峰电流呈现良好的线性关系，相关系数R~2=0.9997。在芯片上对铜绿假单胞菌生物膜形成过程中产生的绿脓菌素进行了长达72 h的电化学监测。结果表明，在铜绿假单胞菌生物膜早期粘附期，绿脓菌素浓度低于1μM，处于较低水平;在生物膜生长期，绿脓菌素浓度迅速增加，可增至100μM以上;在生物膜散播期，绿脓菌素浓度又呈现下降趋势。同时，研究了中药活性组分姜黄素对铜绿假单胞菌生物膜分泌绿脓菌素的影响，发现低于MIC的姜黄素可显著降低绿脓菌素产生水平，最大浓度可降低至38.4μM。


(4)不同抗菌药物与铜绿假单胞菌生物膜相互作用过程的SERS芯片检测和解析。设计制备了用于实时原位监测不同抗菌药物与铜绿假单胞菌生物膜相互作用过程的微腔阵列SERS芯片。采用化学自组装技术，在芯片中集成了均一性、稳定性良好的纳米银SERS基底，分析增强因子可达1.84×10~8，大大增强了铜绿假单胞菌生物膜拉曼信号，对QS信号分子绿脓菌素检测限低至10~(-9)mol/L。利用SERS技术对铜绿假单胞菌与头孢他啶、中药活性组分姜黄素和单宁酸三种不同抗菌药物的相互作用过程进行了长达72 h的无损、原位SERS监测。结果显示，在0～12 h内，650 cm~(-1)、728 cm~(-1)位置处拉曼峰强度逐渐增加，铜绿假单胞菌生物膜生长活跃;在24～36 h内，1350 cm~(-1)位置处绿脓菌素拉曼峰强度很高，产生绿脓菌素QS信号分子;36～72 h后，1350 cm~(-1)位置处绿脓菌素拉曼峰强度降低，其浓度逐渐下降。头孢他啶、姜黄素、单宁酸对铜绿假单胞菌生物膜生长及绿脓菌素抑制作用强弱顺序为头孢他啶姜黄素单宁酸。进一步，采用质谱法对SERS芯片监测结果进行了验证，表明该SERS芯片及其分析检测方法能成功用于研究细菌生物膜与抗菌药物的相互作用过程。