三、材料与方法


01.外接触/互连图案化


采用特定的硅衬底用丙酮和异丙醇超声清洗。硅/二氧化硅衬底经处理后，使用光刻技术对铂接触和互连进行图案化。包括旋涂材料、烘烤、紫外线曝光、蒸发金属、剥离以及冲洗等步骤。


02.3DFG合成


通过等离子体增强化学气相沉积（PECVD）工艺合成3DFG。包括升温、稳定温度、产生等离子体等步骤，并在不同条件下进行合成和冷却。


03.3DFG微电极图案化


3DFG微电极的图案化按照先前文献所述的方法获得。包括沉积二氧化硅薄膜、烘烤和处理、制作铬硬掩模、刻蚀二氧化硅和3DFG、去除掩模和薄膜、处理电极以及钝化等步骤。对3DFG电极进行扫描电子显微镜（SEM）成像，获取了高分辨率图像。固定细胞的SEM成像通过特定方式进行。细胞在特定条件下固定、染色并嵌入树脂中。


04.拉曼光谱学


使用特定仪器和条件进行，在多个点采集了拉曼光谱。紫外可见光谱法3DFG是按照上述方案在1.5厘米×1.5厘米的熔融石英基底上合成的。使用带有氙灯光源和积分球的OL 770多通道分光辐射计获取紫外可见光谱。吸光度的计算方法为：吸光度=1-（反射率+透射率）


05.椭圆偏振光谱法


使用椭圆偏振光谱仪进行了椭圆偏振光谱测量。在与3DFG电极具有相同成分和形态但尺寸更大的样品上进行了光谱采集。在300至1700纳米的波长范围内，以三个入射角测量了椭圆偏振角Ψ和Δ，并进行拟合以获得电极的介电函数。所用的拟合模型包括作为基底的500微米厚的玻璃层（二氧化硅）以及由两个洛伦兹振荡器构成的1.5微米厚的3DFG材料层。3DFG层的厚度值对应于通过横截面扫描电子显微镜成像实验测量的合成3DFG材料的平均厚度。3DFG层的介电函数通过一个振荡器和两个高斯振荡器进行建模。为了全面模拟介电函数实部的色散，添加了两个极点振荡器。这些振荡器函数确保了所获得的3DFG材料介电函数的实部和虚部满足Kramers-Kronig关系。拟合过程很好地重现了实验数据，最终均方误差非常低。


06.光电流测量


使用放大器进行光电流测量。将3DFG MEA放置在倒置显微镜的载物台上，以便将皮秒脉冲激光聚焦在电极上。3DFG MEA的培养孔中充满PBS，铂丝浸入PBS中作为电流测量的参比电极。放大器前置放大器连接到3DFG电极，在激光照射期间采集电压钳（V=0）的轨迹。


07.电化学表征


按照先前文献中所述的方法，使用三电极电池装置中的恒电位仪进行循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）实验。为了使微电极与电解质接触，使用聚二甲基硅氧烷将聚苯乙烯孔密封到MEA芯片上。铂丝和银/氯化银电极分别用作对电极和参比电极。使用PBS作为电解质溶液。在相对于银/氯化银电极的电位范围为-1至1 V的条件下，以500 mV/s的扫描速率进行循环伏安法（CV）测试。电流值根据微电极的几何表面积进行归一化处理。阴极电荷存储容量通过在循环伏安曲线中位于水电解窗口内的电位范围内对阴极电流进行时间积分来计算。电化学阻抗谱（EIS）在0.1至100，000 Hz的频率范围内进行，直流电压（VDC）为0 V，交流电压（VAC）为10 mV。CV和EIS实验均在接地的法拉第笼内进行。对于每种几何尺寸，对多个电极的数据进行分析，并以平均值±标准差表示。


08.生物相容性测试的样品制备


将3DFG和对照基底置于24孔板中，用70%乙醇处理1小时进行灭菌，然后在培养箱中进行2小时的紫外线照射。灭菌后，芯片用1×PBS溶液冲洗三次，然后在室温下用纤连蛋白处理3小时。孵育结束后，吸出多余的纤连蛋白，再用1×PBS溶液冲洗三次。接着，将细胞以一定的密度接种于培养基中。样品在特定条件下培养10天，每隔一天更换一次培养基。培养6天后，对细胞活力和细胞应激进行研究。


09.细胞存活率


细胞存活率的测试遵循了先前的方案。我们使用了Live/Dead检测试剂盒，其中包含钙黄绿素乙酰氧基甲酯和乙锭同聚体染料，分别用于对活细胞和死细胞进行染色。使用Hoechst 33342染料对细胞核进行标记。Hoechst、calcein AM和乙锭同聚体染料分别以1μg/mL、2μM和4μM的终浓度添加到每个样品中，并在37°C和5%CO2条件下孵育30分钟。然后，用10μM的某种物质处理细胞，以解耦细胞的兴奋和收缩，抑制细胞的自发跳动。用1×PBS冲洗细胞三次，然后在37°C下使用直立共聚焦显微镜在20×/0.50数值孔径（NA）的水浸物镜下进行活细胞成像。在四个重复实验（测试样品和对照样品）中进行量化，每个样品采集五张图像。细胞存活率的计算公式为：


存活率=（活细胞数量/细胞总数）×100％。


10.细胞应激


细胞应激通过四甲基罗丹明乙酯检测试剂盒进行检测。TMRE染料是一种可穿透细胞的阳离子红橙色荧光染料，可被活跃的线粒体迅速摄取。将Hoechst和TMRE染料分别以1μg/mL和50 nM的终浓度加入每个样本中，在37°C和5%CO2条件下孵育20分钟。细胞用1×PBS洗涤三次，然后在37°C下使用正置共聚焦显微镜在40×/0.80 NA水浸物镜下进行活细胞成像。从四个重复样本（测试样本和对照样本）中50至60个细胞的单通道（红色）荧光图像中量化荧光强度。数据以平均值±标准差表示。使用学生t检验（双侧）进行统计分析。


11.激光诱导细胞穿孔


细胞光穿孔装置包括一台正置显微镜和一台1064纳米激光器，脉冲宽度为8皮秒，重复周期为12.5纳秒。在实验过程中，MEA采集系统被放置在显微镜的载物台上，以便通过60×水浸物镜（数值孔径=1）将激光聚焦在3DFG电极上。一个程序负责采集电生理信号以及激光刺激。


12.hiPSC-CMs的培养


hiPSC衍生的心肌细胞Cor.4U和Pluricyte细胞购自某处。Cor.4U心肌细胞是心室、心房和结细胞的混合物，而Pluricyte细胞是心室心肌细胞。Cor.4U细胞先在涂有某种物质的培养瓶中培养，用某种盐水去除死细胞，以获得更好的检测性能。之后，Cor.4U细胞用某种溶液分离，并在涂有某种溶液的3DFG-MEAs上培养，培养条件为特定温度和二氧化碳浓度的湿热培养箱。将Pluricyte细胞直接接种于涂有某种物质的3DFG-MEAs上，在特定温度、二氧化碳浓度的加湿培养箱中培养。3DFG-MEAs之前已通过紫外线照射进行灭菌处理。两种细胞系均以每MEA一定数量的细胞的密度接种。根据供应商的建议，Cor.4U细胞在接种后特定天数进行电生理记录，Pluricyte细胞在接种后特定天数进行电生理记录。


13.人诱导多能干细胞心肌细胞的免疫染色


在将人诱导多能干细胞心肌细胞接种于3DFG-MEAs上的第7天，使用人类心肌细胞免疫细胞化学试剂盒对心肌肌钙蛋白T和NKX2-5进行免疫染色。细胞用某种物质固定，然后在通透溶液中孵育。随后，用某种物质阻断，然后在室温下用稀释的一抗在阻断液中孵育。用洗涤缓冲液洗涤三次后，细胞在室温下与稀释的二抗在封闭液中孵育。最后，细胞用某种物质复染，并在正置显微镜上用特定物镜成像。


14.电生理记录


电生理信号是通过一个定制的MEA采集系统获取的，该系统基于Intan Technologies（洛杉矶，加利福尼亚州）的放大器芯片RHA2032。该系统提供24个采集通道，采样率为10千赫兹，增益为200，电压范围为±5毫伏。关于该系统的更多细节可以在之前的工作中找到。信噪比（SNR）的计算方式为20×log10（Signal（V）/Noise（v）），其中噪声计算为无信号时记录轨迹的均方根值的6.6倍。