2.6尿素与植物根尖分生组织上的受体互作所引发的联动变构常数


对公式(4)变形，可以推导出


以1/[RL]为纵坐标，以1/[L]为横坐标的双倒数方程。直线的斜率为Kd/[RT]，横轴截距为-1/Kd，纵轴截距1/[RT]。根据上述推导，再以尿素溶液浓度的倒数为横轴，以电流变化率的倒数为纵轴通过Origin 2019软件线性拟合。


得到拟合的线性回归方程分别为:

由上述方程分别计算得出4种植物的根尖分生组织对尿素的联动变构常数Ka，如表1所示。

表1根尖组织对尿素的联动变构常数


此处的联动变构常数Ka和酶促反应参数Km值相似，定义为:达到组织上传感受体饱和(电化学信号放大效应)一半时的配体浓度。显然Ka越小，说明配体通过与受体互作所产生的电化学信号变化效应越高，传感越灵敏。玉米的Ka值比其他3种植物至少高7个数量级。可以推断玉米相较于其他3种植物，对尿素的传感能力很弱，或可判断为:玉米在一定程度上存在对尿素的传感缺陷。


2.7植物组织传感器的稳定性及重现性


将制成的辣椒根尖组织传感器在1×10-16 mol·L-1的尿素溶液中连续测定10次，电流变化率的RSD为4.73%，表明该受体传感器稳定性能良好。取不同批次制备的电化学型组织传感器5支，制成的玉米根尖组织传感器在1×10-6mol·L-1的尿素溶液中连续测定10次，电流变化率的RSD为2.52%，表明该受体传感器稳定性能良好。


将构建好的根尖组织传感器于4℃的超纯水上方保存，每间隔24 h测定同一浓度的尿素溶液，第1~5天该传感器的响应电流比较为稳定，分别为100%、99.64%、88.32%、75.73%、70.01%;第6天的响应电流比为63.22%，表明该类型组织传感器至少可稳定使用5 d。


2.8辣椒与玉米对尿素传感动力学常数的比较与验证


根据实验结果，玉米与其他3种植物的传感能力有显著差距，辣椒根尖组织可以在10-15~10-10mol·L-1对尿素传感，而玉米在该浓度范围内应无明显的传感能力。为了验证通过植物根尖分生组织传感器所测定的动力学常数是否真实反映了植物根尖对尿素的传感能力，我们以尿素为唯一氮源，在10-15~10-10mol·L-1的尿素培养液中，对玉米和辣椒苗进行培养实验。


如图7所示，我们将玉米与辣椒共同培养在尿素浓度从左至右依次为1×10-10、1×10-11、1×10-12、1×10-13、1×10-14和1×10-15mol·L-1的培养液中。结果表明:玉米在10~15 d内相继死亡，而辣椒在培养液中正常生长。证明了玉米在低于其传感能力的尿素培养液中不能正常生长，而辣椒可以在该尿素浓度范围内正常生长。说明我们通过根尖分生组织研制的传感器及其对尿素的传感参数的确真实地反映了根对尿素的识别、传感和吸收能力，同时发现，和其他3种植物相比，玉米对尿素的传感存在明显的缺陷。

图7玉米和辣椒在从左至右10-10~10-15mol·L-1的尿素溶液中培养


3讨论


过去一些植物学的经典理论认为尿素作为氮肥发挥作用需通过土壤中微生物产生的脲酶水解为CO2和NH3，NH3再被植物吸收利用。但现在越来越多的研究表明:在无土壤微生物存在的条件下，外源尿素也可以被植物根系直接吸收，并在未降解的情况下转运至地上部分。近年来的研究进一步表明:可能存在2类不同的转运体系，即需要能量且逆尿素浓度梯度的主动吸收途径和膜蛋白促进型的尿素跨膜扩散的被动运输途径，即依赖于膜蛋白的尿素低亲和力传感转运体系和高亲和力传感转运体系。通过固定根尖分生组织制备的生物传感器，首次定量化测定了玉米、辣椒、花椰菜和黄瓜根尖分生组织对尿素的识别和传感规律，得到4种植物根尖分生组织与尿素的双曲线动力学模型，并计算出4种植物的重要动力学参数(Ka)，分别为Ka玉米=7.179 0×10-9 mol·L-1;Ka辣椒=4.537 0×10-16 mol·L-1、Ka花椰菜=9.908 5×10-20 mol·L-1和Ka黄瓜=6.462 8×10-21mol·L-1。通过对比发现:玉米对尿素的传感能力远低于其他3种植物。为了验证这些参数的生物学意义，以尿素为唯一氮源，在10-15~10-10mol·L-1尿素的液体培养基中对玉米和辣椒苗进行了培养和验证实验，结果证明:玉米在10~15 d内叶片枯黄死亡，而辣椒则可以正常生长，证明所得到的动力学参数(联动变构常数Ka)真实地反映了植物根系对尿素的传感能力，同时证明:和其他3种植物相比，玉米对尿素的传感存在明显的缺陷，其具体受体及其传感、吸收和控制机制有待进一步深入研究。


4结论


本研究成功地构建了一种植物根尖组织生物传感器，并通过该传感器定量化测定了尿素对玉米、辣椒、花椰菜和黄瓜的根尖组织互作、识别与联动变构常数Ka，通过研究4种植物对尿素的传感动力学，验证了植物根尖可以直接传感尿素，且不同种类的植物传感尿素的能力不同。通过对玉米和辣椒在尿素为唯一氮源的液体培养基上进行的培养实验，证明这些参数的确能够反映植物根系对尿素的识别、传感和吸收能力，同时也发现玉米存在对尿素识别、传感和吸收缺陷，为进一步深入研究植物对尿素的识别、传感、吸收和调控机制奠定了基础。该生物传感器操作简单、易行、成本低、稳定性和重现性良好，为探寻植物根系对土壤中有效营养成分的传感利用及其动力学研究，为合理施肥、提高作物产量等提供了一种新方法。