摘要：该文以沙冬青、绿豆为材料，利用微电极技术实时记录了活体沙冬青和绿豆根冠细胞膜电位对不同盐分的原初响应，分析了质膜转运蛋白抑制剂(Vanadate、TEA)对植物根冠细胞膜电位的影响。结果表明：50、100、200mmol／LNaC1、KC1和LiC1均会引起植物细胞膜电位去极化。对于同一阳离子而言，去极化程度随处理液中离子浓度的增加而加强；对于同一浓度、不同阳离子而言，由于水合离子半径大小不一(K<Na<Li)，在根自由空间的迁移速率不同(K>Na>Li)，因此引起膜电位的去极化程度也存在差异(K>Na>Li)；同一阳离子且同一浓度下对于不同植物来说，绿豆根冠细胞膜电位去极化程度大于沙冬青，即单位时间绿豆根对Na的通透性大于沙冬青。质膜H一ATPase和K通道参与了沙冬青和绿豆在盐胁迫时的原初响应，K通道可能参与了Na的跨膜转运。


植物抵抗环境胁迫的能力取决于植物感知胁迫和激活防御响应的效率⋯。植物通过根细胞质膜上的离子转运蛋白完成对根系附近K、Na等的选择性吸收。质膜上与离子转运及抗盐性有关的膜转运蛋白主要有3类：泵、载体和离子通道。其中离子通道的开闭与细胞质膜的极化和去极化程度有直接关系。Yao等的研究表明，NaC1会引起植物细胞膜电位去极化；安国勇等认为小麦(Triticumaestivum)根细胞膜电位变化可调控质膜K通道开闭，100mmol／LNaC1引起小麦根细胞膜电位去极化，并伴随着细胞内K含量降低，而10 mmol／L CaC1可以稳定细胞膜电位，抑制NaC1引起的膜电位变化，从而促进小麦根对K的积累。前人对植物细胞跨膜电位的研究，多集中于小麦、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等作物在养分吸收过程中养分离子的跨膜转运方面。对于木本植物在盐胁迫下，细胞膜电位的实时瞬态变化特征尚无报道。沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)属于豆科(Leguminosae)、沙冬青属(Ammopiptanthus)，是珍稀濒危和重点保护植物，也是我国荒漠中唯一的常绿阔叶灌木。在沙漠生长的植物中有活化石之称。以往由于试验技术等原因，对活体沙冬青遭受盐胁迫时的实时瞬态响应研究甚少。本实验利用微电极实时记录了耐盐性强的沙冬青和耐盐性弱的绿豆(PhaseolusradiatusL．)在盐胁迫条件下细胞膜电位(plasmamembranepotentia1)的原初响应特征，在膜水平上探讨植物的耐盐机制。实验证明，微电极测定膜电位，方法简便、快捷、灵敏度高，不仅为研究植物对盐胁迫的快速响应提供一种新的方法，而且能够为进一步揭示植物感知盐胁迫及忍耐盐胁迫的机制提供重要参考。


1材料与方法


1．1材料培养与处理


选取大小均匀、饱满的沙冬青和绿豆种子，先用70％乙醇表面消毒10min，再用10％的NaC10处理25min后，放入垫有滤纸且已经灭菌的培养皿中，加人材料培养液(表1)，用封口膜封好(以上操作均在无菌条件下完成)。于25℃恒温、黑暗人工气候箱(HPG一280H)中生长。待幼根长至0．5am左右时，挑选长短一致的沙冬青和绿豆幼苗，分别放入装有空白测定液(表1)的测试槽中，静置平衡后测定幼根根冠区(距根尖400肚m处)细胞膜电位。不同处理的测定液(如100mmol／LNaC1、KC1)是通过直接加入一定浓度的相应化学物质的母液至空白测定液中经扩散后而得到。


微电极制作实验用微电极选择内径为0．9mm、外径为1．5mm的硼硅酸有芯玻璃毛细管，在拉制仪(NarishigePP一830，Japan)上采用两步法拉制而成。制成的微电极尖端直径约为0．5～1 m，微电极灌充液为100mmol／LKC1。参考电极为Ag／AgC1。


1．3膜片钳系统测定根冠细胞膜电位


1．3．1静息膜电位测定


选择健康幼根固定在透明玻璃槽内，加5mL空白测定液，静置平衡10min，接通电路，在OlympusIX71倒置显微镜下借助显微操纵器(MP-285)轻轻将微电极(测量电极)刺入待测幼根根冠区(距根尖400p．m处)细胞。微电极另一端连接Axon公司的Multiclamp700B放大器和Digidata 1322A数模转换器，完成细胞膜电位信号的放大、采集和转换。数据分析用Clampex9．2软件。静息膜电位测定分别用不同幼根重复l0次。


1．3．2不同处理下膜电位测定


当幼根在空白测定液中的静息膜电位平稳后，改变测定液成分实时记录幼根根冠细胞膜电位随外界环境变化而发生的原初响应。本实验比较了50、100、200mmol／L一价阳离子氯盐NaC1、KC1和LiC1对沙冬青和绿豆根冠细胞膜电位的影响。


另外，利用质膜H一ATPase活性专一抑制剂——钒酸盐(Vanadate)、质膜K通道抑制剂TEA分析活体植物根冠细胞膜电位与膜转运蛋白活性的关系。在放有沙冬青和绿豆的空白测定液中先加入1mmol／LVanadate或10mmol／LTEA平衡10min后，进行膜电位测定。当静息膜电位平稳后加入100mmol／LNaC1处理，实时记录膜电位变化趋势。以空白测定液中直接加入100mmol／LNaC1时沙冬青和绿豆根冠细胞膜电位的变化为对照。